细胞凋亡与疾病 病理生理教研室王生兰

悉尼 - 布雷内 罗伯特 - 霍维茨约翰 - 苏尔斯顿 2002 年诺贝尔生理学或医学奖分别授予了英国科 学家悉尼 · 布雷内 (Sydney Brenner) 、美国科学家罗 伯特 · 霍维茨 (H.Robert Horvitz) 和英国科学家约翰 · 苏 尔斯顿 (John E.Sulston) ，以表彰他们发现了在器官 发育和 “ 程序性细胞死亡 ” 过程中的基因规则。

内 容  细胞凋亡概述  细胞凋亡的形态学和生物化学特征  细胞凋亡的分子调控机理  细胞凋亡的发生机制  细胞凋亡与疾病

细胞凋亡 (Apoptosis)  早在 1972 年 Kerr 等已发现从细胞形态、超微结 构和生化变化等方面来分析，细胞有二种死亡形 式, 一种是早被熟知的细胞坏死（ Necrosis ）， 另一种是新提出的程序性细胞死亡 （ Programmed cell death, PCD ）学说。现在 普遍称之为细胞凋亡（ Apoptosis ）  细胞凋亡由体内外因素触发细胞内预存的死亡程 序而导致的细胞死亡过程。  是一个由基因调控的细胞主动结束生命的过程。

100% Apoptosis: induced by BL-106 (5mM) that binds to bcl-2. Nuclear stained with Hoechest33258

细胞凋亡与细胞坏死的区别 ——————————————————— 坏死 凋亡 1. 性质 2. 诱导因素强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生 3. 生化特点 4. 形态变化 6.DNA 电泳 5. 炎症反应 7. 凋亡小体 8. 基因调控 被动过程，无新蛋白合成， 不耗能 主动过程，有新蛋白合成， 耗能 细胞结构全面溶解、破坏、 细胞肿胀 胞膜及细胞器相对完整 细胞皱缩，核固缩 弥散性降解，电泳呈均一 DNA 片状 DNA 片段化（ bp ）， 电泳呈 “ 梯 ” 状条带 溶酶体破裂，局部炎症 反应 溶酶体相对完整，局部 无炎症反应 有 病理性，非特异性生理性或病理性，特异性 无有 无

细胞凋亡的生理意义  确保正常发育、生长  维持内环境稳定  发挥积极的防御功能 蝌蚪尾的消失 脊椎动物的神经系 统的发 发育过程中手和足 的成形过程

凋亡过程 凋亡诱导因素凋亡诱导因素 受体受体 cAMP Ca 2+ 神 经 酰 胺 死亡信号死亡信号 凋亡相关基因激活凋亡相关基因激活 Dnase 激 活 Caspases 激活 巨噬细胞 吞噬分解 凋亡细胞

凋亡过程可分为三个阶段 : 诱诱导期 : 细胞凋亡相关因素的作用和细胞信号转 导 ; 效效应期 : 相关基因接受死亡信号后按预定程序启 动合成执行凋亡所需的各种酶类及相关物质, 并 引起核酸内切酶和 caspase 家族的级联反应 ; 降降解期 : 底物降解, 包括核酸内切酶彻底破坏细 胞生命活动所必须的全部基因, caspase 导致细 胞结构的全面解体, 完成细胞凋亡。

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形态学特征 ■凋亡细胞（实体细胞）与周围细胞脱接触 ■胞膜空泡化（ Blebbing ） ■细胞固缩（ Condensation ）、核固缩和出芽 (Budding) 、染 色体边集（ Margination ） ■凋亡小体（ Apoptotic body ）

生物化学特征  胞浆内 Ca 2+ 浓度升高。  细胞内活性氧增多。  质膜通透性变大。  DNA 内切酶活性被激活升 高，双链 DNA 在核小体之 间切断形成 180~200bp 为 基数的有序片段。  Ⅱ型谷氨酰胺转移酶和需钙 蛋白酶（ Calpain ）活性升 高。  细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻 典型凋亡细胞 DNA 琼脂糖凝胶电 泳呈现梯状条带

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促进细胞凋亡：生物及化学毒物、病毒感染、射线、应激和 化疗药等。 抑制细胞凋亡：化学促癌物、某些病毒（ EB 病毒，人类乳头 状瘤病毒） （一）凋亡信号 生理性凋亡信号 （ 1 ）某些激素和细胞因子的直接作用：强烈应激 →GC→ 淋巴 细胞凋亡 （ 2 ）某些激素和细胞因子的间接作用：睾丸酮对前列腺上皮 细胞； ACTH 对肾上腺皮质细胞。 病理性凋亡信号

病理性信号可经以下环节诱导凋亡  氧化应激作用  死亡受体的激活  线粒体结构和功能的改变  其他：钙离子的作用

（二）细胞凋亡过程中的信号转导 1.Fas/CD95 信号转导途径 2. TNFR-1 信号转导途径

3. 酪氨酸蛋白激酶信号系统 （负调控作用） 靶蛋白 磷酸化 受体 TPK P GDP GTP MEK ERK Raf 靶基因 转录 (extracellular signal regulated kinase ， ERK) 生长因子 Grb2 Sos Ras Tyrosine protein kinase-mediated signal transduction pathway

cAMP PKA 靶蛋白 磷酸化 靶基因 转录 腺苷酸环化酶 ＋  受体 α2 受体 M 受体 Gs Gi － Adenylyl cyclase signal transduction pathway 4. cAMP/PKA 信号系统

靶蛋白 磷酸化 靶基因 转录 α1 受体 AngII 受体 PIP 2 PKC Ca 2 ＋ Gq IP 3 DAG PLC β Phospholipase C signal transduction pathway 5. 胞内 Ca 2+ 信号系统

GHGH Growth hormone receptor signaling through the JAK/STAT pathway GH receptor JAK P STAT P Target gene STAT （ STAT1 可激活细胞 周期依赖性激酶的抑 制分子 p21 的转录, 而 且 STAT1 是某些细胞 发生凋亡所必须； STAT3 则可能对促进 凋亡的 Bax 分子表达 有诱导作用） 6. JAK-STAT 通路

7. 神经酰胺信号系统 神经鞘磷脂 神经酰胺 细胞凋亡 电离辐射、 TNF-α 、 Fas 抗原、糖皮质激素均可通过神经酰 胺信号系统诱导细胞凋亡。 8. TRAIL 介导的凋亡信号通路 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（ TNF related apoptosis inducing ligand, TRAIL ）, TRAIL 诱导的凋亡与 TNF 相似, 它与相应的受体结合后可激活 NF-κ Ｂ、 JNK 通 路和 Caspases 级联。但目前对 TRAIL 受体诱导的凋亡机制 仍有许多争议。 SM 酶

Hengartner, M.O Nature. 407:770. Green, D. and Kroemer, G Trends Cell Biol. 8:267. Mitochondrial Pathway Death Receptor Pathway FasL Caspase 3 DD D D Fas/Apo1 /CD95 FADD Procaspase 8 Caspase 8 BID oxidants ceramideothers Bcl-2 D Cytochrome c dATP Procaspase 9 Apaf -1 dATP Apaf -1 Caspase 9 Procaspase 3 apoptosome DNA damage Cellular targets （三）细胞凋亡的途径

（四）细胞凋亡的执行  Caspase 家族  凋亡的执行者  特点：前体形式存在, 级联反应  作用：  灭活凋亡抑制物  水解蛋白质结构，形成凋亡小体  水解凋亡相关活性蛋白  瓦解核结构成碎片

1 、 Caspases 1 、 Caspases 概念 Caspase 属于半胱氨酸蛋白酶家族， 14 个成员 (Caspase 1-14) 。 概念 Caspase 属于半胱氨酸蛋白酶家族， 14 个成员 (Caspase 1-14) 。 Caspase 活性位点是半胱氨酸，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后 的肽键，因此称为 Cysteine aspartic acic specific protease ，即 Caspase细胞凋亡异常 Cas pase 信号通路分类 Cas pase 信号通路分类 上游（ Caspase-8, -9, -10 ） 下游（ Caspase -2, -3,-6,-7 ）（共同通路） Caspase ▲ Caspase （ Ced-3 亚家族） 死亡受体通路线粒体途径 大小亚基结合（二聚体） caspase 活化（四聚体）结构特点 Pro-caspase ： NH 2 末端结构域、 20KD 亚基、 10KD 亚基 剪切

 使抑制凋亡因子失 活，如 CAD/ICAD Bcl-2  破坏细胞结构，如 Lamina  将调节区与催化区 分离，使蛋白失活， 如 Gelsolin  分解核结构成碎片 Caspase 如何杀死细胞？

（四）细胞凋亡的执行  内源性核酸内切酶 作用：切割染色质 DNA 特点： Ca 2+ Mg 2+ 依赖 Zn 2+ 抑制  其他：钙离子

（五）细胞凋亡的基因调控  Bcl-2 家族 抗凋亡成员： Bcl-2 和 Bcl-XL 促凋亡成员： Bax 和 Bak BH3-only 死亡蛋白 凋亡相关基因 : 抑制凋亡的基因： EIB 、 IAP 、 Bcl-2 促进凋亡的基因： Fas 、 Bax 、 ICE 、 P53 双向调控基因： c-myc 、 Bclx

（五）细胞凋亡的基因调控 Bcl-2 B 淋巴细胞瘤 / 白血病 2 （ B cell lymphoma/leukenia-2 ） 分布：造血细胞，上皮细胞，淋巴细胞，多种瘤细胞 （线粒体内膜、细胞膜内表面、内质网和核膜等处） Bcl-2 抗凋亡的机制： ⑴直接抗氧化 ⑵抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质 ⑶抑制促凋亡调节蛋白 Bax 、 Bak 的细胞毒作用 ⑷抑制凋亡蛋白酶的激活 ⑸维持细胞钙稳态

（五）细胞凋亡的基因调控  P53 诱导凋亡的基因 P53 “ 分子警察 ”(molecular policeman) 其他双向调节基因 c-myc

（六）吞噬细胞对凋亡细胞的识别与吞噬  吞噬细胞凝集素的作用  血小板反应蛋白介导吞噬  磷脂酰丝氨酸的作用

细胞凋亡发生的时间过程

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细胞凋亡发生机制 （一）氧化损伤 （二）钙稳态失衡 ( 三 ) 线粒体损伤

( 一 ) 氧化损伤 细胞凋亡 氧自由基 → DNA 损伤 → 多聚 ADP 核酸合成酶活化 → 氧自由基 → DNA 损伤 →p53 激活 → NAD 耗竭 ATP 消耗 → 细胞凋亡 氧自由基 → 细胞膜过氧 化损伤 → → 细胞凋亡 → → 细胞凋亡 氧化应激 → 核酸内切酶激活 （ Ca 2+ /Mg 2+ ） → 细胞凋亡 Ca 2+ 内流 ↑ 过氧羟基 24 碳四烯酸 氧自由基 → 线粒体膜损伤 → 通透性 ↑ 膜电位 改变 → 细胞 凋亡 氧化应激 → NF-κB,AP-1 活化 → 凋亡相关基因表达 → 细胞凋亡

（二）钙稳态失衡 1. 激活核酸内切酶 → 2. 激活谷氨酰氨转移酶 → 降解 DNA 链 酰基转移 → 蛋白交联 → 形成凋亡小体 3. 激活核转录因子 → 凋亡相关蛋白表达 → 凋亡 4.Ca 2+ → ATP DNA 舒展 → 核小体间酶切点暴露 →DNA 内切酶切割 DNA

( 三 ) 线粒体损伤 膜通透性 ↑ 、线粒体肿胀、△  m↓ Apaf-1 活化 Cyt.c Ca 2+ NO缺血缺氧活性氧 MPT 开放 Cyt.c + Pro-caspase-9 Caspase-9 ATP Apaf-1 + Apaf-1 活化 Cyt.c CARD apoptosome细胞凋亡异常 AIF AIF caspase-independent apoptosis Pro-Caspase-3 Caspase-3

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该 “ 死 ” 的细胞 （如 肿瘤细胞 、 自 身反应性免疫细胞 ） 未死 ， 是造成 肿瘤、自身免疫性疾病的主要发 病机制之一。 细胞凋亡与疾病发生机制的 新认识

不该 “ 死 ” 的细胞 （ 如神经元、心肌 细胞 ） 死了 ， 这与老年性痴呆、 心肌缺血 / 再灌注损伤等发病有关 。 细胞凋亡与疾病发生机制的 新认识

 细胞凋亡不足：  肿瘤，自身免疫病  细胞凋亡过度：  心肌缺血，心力衰竭，神经元退行性疾病，病毒感 染 凋亡与疾病

与细胞凋亡有关的疾病

NATURE CELL BIOLOGY VOL 4 JUNE 2002 细胞凋亡与肿瘤 1. 细胞凋亡与肿瘤发生 凋亡抑制 (Bcl-2 、 P53) 2. 细胞凋亡与肿瘤发展 细胞增殖和凋 亡比例失衡 3. 细胞凋亡与肿瘤转移 环境变化凋亡减少

HIV 与 T 细胞凋亡 对 HIV 感染 T 细胞的影响： 1. 多个细胞胞膜融合形成合胞体 2. 病毒持续出胞和 HIV 蛋白对细胞膜的损伤 3. 病毒复制形成的线状 RNA 对细胞有毒性作用 4. HIV 打破 Bcl-2 家族中抗凋亡、促凋亡因素的平衡 5. HIV 蛋白可增加 Fas 和 FasL 的表达 6. HIV 蛋白酶可使 Bcl-2 失活，同时激活 Caspase-8

对旁观者细胞的影响： 1.T 细胞激活 - 激活诱导的细胞死亡 （ activation-induced cell death, AICD ） 2.Gp120 糖蛋白诱导细胞凋亡 3.Tat 蛋白进入旁观者细胞 - 诱导氧自由基产 生 -Fas 表达增强 - 细胞凋亡 4. 细胞因子的作用 -TNF

细胞凋亡与心肌缺血及缺血 - 再灌注损伤 特点 : 缺血早期以凋亡为主，晚期以细胞的坏死为主。 缺血早期以凋亡为主，晚期以细胞的坏死为主。 在梗死灶的中心以坏死为主，梗死灶周边以凋亡为 主； 在梗死灶的中心以坏死为主，梗死灶周边以凋亡为 主； 轻度缺血以凋亡为主，重度缺血以坏死为主； 轻度缺血以凋亡为主，重度缺血以坏死为主； 机制 : 氧化应激、 FasR 通路、 p53 基因的转录增加。 氧化应激、 FasR 通路、 p53 基因的转录增加。

细胞凋亡和阿尔茨海默病 老年痴呆, 它的发病机制主要是细胞凋亡所致神经 元丧失 1.Fas 抗原的介导 2.p53 基因的活化 3.c-Jun 和 c-foc 及其编码蛋白的作用 4.APP695 基因突变的作用 5. 低亲和力神经生长因子高表达 6.NF- κ B 的活化

细胞凋亡在帕金森病发病中的作用 帕金森病（ Parkinson disease ）是中老年人常见的中枢神 经系统变性疾病，病变主要累及黑质和黑质纹状体，脑 黑质的多巴胺能神经元变性、退化 - 纹状体内多巴胺和乙 酰胆碱失衡而发病。 1. 氧化应激是黑质多巴胺能神经元凋亡的重要过程 2. 钙稳态失衡与黑质多巴胺能神经元凋亡 3. 线粒体损伤在黑质多巴胺能神经元凋亡中的作用 4.Bcl-2 和 Bax 蛋白是黑质多巴胺能神经元凋亡的调控因子 5. Caspase 酶是黑质多巴胺能神经元凋亡的效应分子

细胞凋亡在动脉粥样硬化中的作用 动脉粥样硬化（ atherosclerosis,AS ）是指发生在大型或中型弹性动 脉、肌性动脉壁内膜及内膜下，以脂质沉着，并伴有中层血管平滑 肌细胞向内膜移行、增殖为特征，内膜增厚发展而形成的粥样病灶 或纤维脂质斑块。 １.P53 突变 → 血管平滑肌细胞增殖 ２.bcl-2 表达，促进内膜增生血管肥厚 ３.NO 通过 P53 和 bcl-2 途径促进或抑制细胞凋亡 ４. 泡沫细胞膜表达 Fas → 泡沫细胞和Ｔ细胞凋亡 5. NF-κ Ｂ活化抗细胞凋亡基因

细胞凋亡在疾病防治中的意义 可以通过不同的手段在不同的阶段进行干预而治 疗疾病 合理利用凋亡相关因素 干预凋亡信号转导 调节凋亡相关基因 控制凋亡相关酶学机制

细胞凋亡 — 生命的选择

作业： 名词解释： 1 、核受体 2 、激素抵抗综合征 3 、跨膜细胞信号转导 4 、分子警察 问答题： 1 、试述受体异常与疾病。 2 、试述细胞凋亡与坏死的区别。