Syntheses, Properties and Structure of Alternating Copolymers August 10-12, 2015, Biopolymers and Bioplastics 2015 (San Francisco, USA) Syntheses, Properties and Structure of Alternating Copolymers of 3-Hydroxybutyrate and Lactate Units Hideki ABE Bioplastic Research Team, Biomass Engineering Research Division, RIKEN Center for Sustainable Resource Science (JAPAN)

Bacterially synthesized Poly(hydroxyalkanoate)s (PHAs) Sugars Fatty acids Plant oils 1 mm P(3HB) P(3HB)-based copolymers P(3HB-co-LA) The structure and properties of random copolymers containing 3HB units have been examined, and it has been found that the physical and thermal properties of P(3HB)-based copolymers be regulated by varying their molecular structure and copolymer compositions.

Regulation of sequential structure of copolymers Different sequential structure for copolymer Blocking tendency Alternating tendency Block copolymer Random copolymer Alternating copolymer The variation in sequential distribution of monomeric units for copolymers will certainly expand the properties and functions of PHAs and their applications! However, in comparison with random copolymers containing 3HB units, the investigation on the copolymers with different sequential structure is still few. Understanding the relationship between sequential distribution and properties is valuable to design the copolymer molecules with desirable properties.

Syntheses of alternating copolymers of 3HB and LA units Syntheses of alternating copolymers of 3-hydroxybutyrate and lactate Preparations of macromonomers (R)-3HB Methyl ester TBDPS-(R)-3HB (S)-LA (S)-LA-Bn (R)-3HB-(S)-LA Total Yield: 46 % (R)-LA (R)-LA-Bn (R)-3HB-(R)-LA Total Yield: 24 % (R)-3HB-rac-LA R:S = 50:50 Polycondensation Sample No. Macro Monomer Yield (%) Molecular　weight (×103 g/mol) Mn Mw Mw/Mn 1 3HB-(S)-LA 41 72.4 143.1 2.0 2 3HB-rac-LA 37 45.8 83.2 1.8 3 3HB-(R)-LA 77 7.3 11.1 1.5

1H NMR spectra of alternating copolymers of 1 2 3 4 5 6 7 δ (ppm) 8 5.0 5.2 5.4 4.8 2.6 2.8 Methylene group(CH2) Methyl group(CH3) Methine group(CH2) 1.2 1.4 1.6 1H-NMR 9 CHCl3 HFIP TMS 1H NMR spectra of alternating copolymers of 3HB and LA units (S)-LA rac-LA (R)-LA

Thermal properties of alternating copolymers of 3HB and LA units 1st Scan (0 to 250 °C) (R)-LA rac-LA (S)-LA 50 100 150 200 250 2nd Scan (0 to 250 °C) 50 100 150 200 250 Temperature (°C) sample 1st Scan 2nd Scan Tm (°C) ΔHm (J/g) Tg Tdmax P[(R)-3HB-alt-(S)-LA] 83 51 19 - 299 P[(R)-3HB-alt-(R)-LA] 233 120 232 99 298 P[(R)-3HB-alt-rac-LA] 52,126 14 20 125 16 295 P[(R)-3HB-co-(S)-47mol%LA] 30 290 P[(R)-3HB] 176 96 4 178 82 286 PLA 43 60 40 374 All alternating copolymers of 3HB and LA units are crystallizable. Depending on the configuration and chirality of LA, the melting temperature of copolymers is significantly varied.

Crystallization behavior of alternating copolymers X-ray diffraction patterns 10 15 20 25 30 P[(R)-3HB] PLA P[(R)-3HB-alt-(R)-LA] P[(R)-3HB-alt-(S)-LA] 2θ (°) Each polymer forms different crystalline structure. Crystallization phenomenon for P[(R)-3HB-alt-(R)-LA] Heating process @ 200 °C Heating process @ 240 °C Quenched @ 200 °C, 0 s Quenched @ 200 °C, 20 s Quenched @ 200 °C, 100 s Crystallization of P(3HB-alt-(R)-2HP) occurs very rapidly

Syntheses of alternating copolymers of 3HB and LA units in combination with different configurations P[(S)-3HB-alt-(S)-LA] P[(S)-3HB-alt-(R)-LA] P[(R)-3HB-alt-(R)-LA] P[(R)-3HB-alt-(S)-LA] (R)-3HB (S)-3HB (R)-LA (S)-LA Sample Solubility Molecular weight Thermal properties Xc ,％ In CHCl3 Mn, g/mol PDI Tg, °C Tm, ΔHm, J/g P[(R)-3HB-alt-(R)-LA] × 7,000 1.5 n.d. 233 116 81 ± 5 P[(R)-3HB-alt-(S)-LA] ○ 72,000 2.0 19 83 52 73 ± 5 P[(S)-3HB-alt-(R)-LA] 1.9 11 80 54 P[(S)-3HB-alt-(S)-LA] 3,000 2.5 113

X-ray diffraction patterns of alternating copolymers 10 15 20 25 30 P[(R)-3HB-alt-(R)-LA] P[(R)-3HB-alt-(S)-LA] P[(S)-3HB-alt-(R)-LA] P[(S)-3HB-alt-(S)-LA] 2θ (°)

Syntheses of alternating copolymers of 3HB and LA units by mixing different stereoisomers (R)-3HB-(S)-LA (R)-3HB-(R)-LA P[(R)-3HB-alt-(R,S)-LA] 50 100 150 200 250 20 40 60 80 (R)-LA feed ratio (mol%) Melting temperature, Tm (°C) Heat of fusion, ΔHm (J/g) 25 50 75 100 125 20 40 60 80 (R)-LA feed ratio (mol%) ①　さらに、２HPユニットの立体選択に着目し、２HPユニットの異なる立体性を有する交互共重合体を合成し、DSCを用いて熱物性を評価しました。 ②　合成した交互共重合体の熱物性はR２HPユニットの仕込み比で融点、融解熱をプロットしました。 ③　その結果、立体選択によって融解温度は５０°Cから２３０°Cまでの幅広い範囲で制御できることがわかりました。 ④　これらの結果から、交互共重合体における立体性は非常に重要であり、物性を左右する大きな要因となることがわかりました。

X-ray diffraction patterns of alternating copolymers 2θ (°) 10 15 20 25 30 P[(R)-3HB-alt-(R)-LA] (R/S=100/0) P[(R)-3HB-alt-(R,S)-LA] (R/S=75/25) P[(R)-3HB-alt-(R,S)-LA] (R/S=67/33) P[(R)-3HB-alt-(R,S)-LA] (R/S=50/50) P[(R)-3HB-alt-(R,S)-LA] (R/S=33/67) P[(R)-3HB-alt-(S)-LA] (R/S=0/100)

× Preparation of single crystals for alternating copolymer Poor solvent Good solvent Chloroform, methanol, ethanol × Hexafluoroisopropanol（HFIP） Mixing ratio, temperature, time Optimize the crystallization conditions Preparation of single crystals of P[(R)-3HB-alt-(R)-LA] AFM image polymer sample/solvent (HFIP/Methanol= 6/4)=2 mg/10mL 2 μm Silicon wafer dropwise drying Observation 129 °C, 30 min heating 99°C, 6 h Isothermal crystallization ①　続いて、結晶構造解析に用いる単結晶を得るため、結晶化の条件を検討しました。 ②　貧溶媒と良溶媒の混合比、溶解温度、結晶化温度を調べ、結晶化条件を最適化しました。 ③　そのなかで、最適な条件として、良溶媒にHFIP、貧溶媒にメタノールを用い、６０対４０で混合し、１２９°Cで溶解させ、９９°Cで６時間等温保持することで、結晶化を行ないました。得られた単結晶を含む懸濁液をシリコンウエハ上に滴下し、乾燥した後、それを原子間力顕微鏡、AFMにて観察を行ないました。 ④　その結果、こちらに示すような２μｍ程度のひし形の単結晶が生成されたことを確認しました。

Electron diffraction of single crystals for alternating copolymer drying Observation Carbon coated Cu grid TEM Single crystal Electron diffraction pattern 50 nm a* b* ①　続いて、銅製のメッシュグリッドをカーボンコートし、その上に懸濁液を滴下し、乾燥した後、透過型電子顕微鏡（TEM）で観察を行ないました。 ②　形態としてはこのような単結晶を観ることができ、つづいて制限視野電子線回折により、このようなはっきりとした電子線回折を観ることができました。 ③　この回折点を模式的にこちらに示しており、逆格子定数を算出したところ、a*=2.100 nm-1、b*=1.133 nm-1、γ＝９０°であることがわかりました。 ④　また回折点の強弱をみると、本来中心から近い１００や０１０が最も強くなりますが、今回の回折点では０６０が最も強く回折を示すことからこの結晶が斜方晶ではなく、少し傾いた結晶系になっていることを示唆しています。 Diffraction patterns can be indexed via the reciprocal lattice parameters of a* = 2.100 nm-1, b* = 1.133 nm-1, γ = 90°

Irradiated from vertical plane Irradiated from horizontal plane X-ray diffraction of sediment mats of single crystals for alternating copolymer c filtration X-ray A c* a*, b* Irradiated from vertical plane X-ray Irradiated from horizontal plane ①　先ほど生成した単結晶の懸濁液を今度はメンブレンフィルターで濾過することにより、単結晶を積層させた単結晶マットを作製しました。 ②　この単結晶マットを用い、透過型の広角X線回折をX線の照射向きを変えて行ないました。 ③　c軸方向に垂直にX線を照射した場合の回折図では、アーク状の回折を観ることができ、これらは赤道上でhk０の回折であると推測されます。また、c軸に関わる００lに関する回折をみることができ、このサンプルが配向性の試料として有効であることを示しています。 ④　一方で、ab面に対して垂直にX線を照射した場合、アーク状の反射やc軸に関わる反射をみることはできませんでした。

P[(R)-3HB-alt-(R)-LA] Predicted crystal structure of alternating copolymer Monoclinic 　a = 0.933 nm 　b = 0.904 nm 　c = 2.138 nm 　β = 82 ° c-axis a b (nm) helix zigzag 3HB 0.298 0.460 LA 0.278-0.300 - ＝ (R)-3HB (R)-LA 3HB: near planar zigzag conformation LA: helical conformation 2.138 nm(calc.)÷3=0.712 nm c a cosβ PGA P[(R)-3HB-alt-(R)-LA] Tm (℃) Density (g/cm3) 230 1.69 233 1.77

CP/MAS 13C NMR spectra of alternating copolymers of 3HB and LA units CP/MAS 13C NMR P[(R)-3HB-alt-(S)-LA] CH3 HA HB HC C O gauche CH3 CH C=O CH2 P[(R)-3HB-alt-(R)-LA] CH3 HA HB HC C O trans ①　さらに、結晶内部における分子鎖の知見を得るため、固体NMRを測定しました。 ②　それぞれの炭素源に由来するシグナルにおいて、R体とS体の交互共重合体で違いを観ることができます。 ③　特に、３HBユニットのコンフィグレーションはR体で同じですが、２HPユニットの立体性によって３HBユニットのメチレン基に由来するシグナルは変化しております。 ④　R体の２HPの交互共重合体では、高次場側にシフトしており、こちらの交互共重合体では３HBユニットはトランス型のコンフォメーションをとっていることを示唆しております。

Thank you for your attention! Conclusion We succeeded in syntheses of alternating copolymers of 3HB and 2HP units by condensation reaction of macromonomers. The melting temperature and crystalline structure of alternating copolymers were varied depending on the configuration and chirality of 2HP units. The alternating copolymers of (R)-3HB and (R)-2HP units or (S)-3HB and (S)-2HP units showed higher melting temperature compared with those of the homopolymers. Crystalline structure of the alternating copolymers was examined by X-ray and electron diffraction analyses for single crystal. Predicted crystalline structure of the alternating copolymer revealed that the alternating copolymer chain be packed densely in the unit cell. Thank you for your attention!