I primi tentativi di domesticazione delle legnose da frutto furono possibili grazie a tecniche abbastanza semplici di moltiplicazione agamica (talea). Grazie all’affinamento di tecniche più complesse, prima fra tutte l‘innesto, fu possibile, verso il I millennio a. C., sfruttare i vantaggi della propagazione vegetativa. I popoli del bacino del Mediterraneo impararono bene a innestare olivi; appresero presto il vantaggio di innestare le marze di mandorli altamente produttivi su portainnesti meno fecondi o su quelli con frutti amari. Anche se non se ne conosce la provenienza esatta, sappiamo che l’innesto era ben conosciuto da Greci e Romani i quali, probabilmente, avevano appreso questa tecnica contemporaneamente all’introduzione di agrumi dall’Estremo Oriente. Oggi, la maggior parte delle specie di piante coltivate vengono propagate per via agamica con lo scopo di conservare alcune caratteristiche essenziali, sia perché sono sterili, sia perché il loro genoma è troppo complesso e quindi la riproduzione gamica rischia di determinare delle gravi variazioni fenotipiche. LA PROPAGAZIONE AGAMICA Riproduzione tramite parti vegetative della pianta originale. resa possibile dal fatto che ogni cellula contiene le informazioni genetiche necessarie per la rigenerazione di un’ intera pianta.

Perpetuazione di un clone. La propagazione vegetativa è asessuata, avviene cioè attraverso la divisione di cellule mitotiche con la duplicazione del genotipo della pianta. Tale duplicazione genetica è conosciuta come clonazione. (Pro: uniformità di aspetto, dimensioni, tempi di fioritura e maturazione, caratteristiche della frutta; Contro: attacco patogeno). Moltiplicazione di piante apirene. La propagazione agamica è necessaria per conservare cultivar che non producono semi germinabili. Accorciamento del periodo giovanile. Le piante nate da seme attraversano una fase giovanile. In alcune piante legnose sono necessari anni prima che la pianta raggiunga la fase adulta ed inizi a fiorire. Nella propagazione vegetativa si conserva la capacità di fiorire e la fase giovanile viene evitata ( piante propagate con gemme tolte da una pianta in fase adulta iniziano a fiorire prima). Combinazioni di cloni (innesto). Economia. La riproduzione vegetativa di massa non è meno costosa di quella per seme, ma è giustificata dalla superiorità ed uniformità degli specifici cloni. Il risparmio è comunque ottenuto con l’accorciamento della fase giovanile e del tempo necessario per raggiungere la maturità riproduttiva. LA PROPAGAZIONE AGAMICA

Per le legnose da frutto il mantenimento delle caratteristiche positive della pianta madre nelle generazioni successive è possibile in pratica solo se si ricorre alla propagazione vegetativa, questo perché nei fruttiferi si ha con molta frequenza l‘impollinazione incrociata e, conseguentemente, un alto livello di eterozigosi che comporta una grande variabilità nella discendenza ottenuta da seme. La produzione di piante nella moderna frutticoltura è prevalentemente affidata alla propagazione vegetativa mediante taleaggio, innesto e micropropagazione. Tale variabilità, dovuta all’unione di patrimoni genetici diversi, è un bene prezioso quando si ricercano nuove combinazioni, particolarmente desiderabili per la creazione di varietà moderne, ma se l’obiettivo è quello di ottenere dei cloni, cioè discendenze con le stesse caratteristiche genotipiche (e quindi con le stesse caratteristiche organolettiche e produttive) della pianta madre, si deve ricorrere necessariamente alla propagazione vegetativa. LA PROPAGAZIONE AGAMICA

INNESTO MARGOTTA TALEA PROPAGAZIONE IN VIVO

MICROPROPAGAZIONE Propagazione di massa. Ottenere in tempi brevi ed a costi contenuti, un grande numero di piantine, identiche sia genotipicamente che fenotipicamente alla pianta di partenza precedentemente selezionata per caratteristiche fisiologiche e produttive di pregio. Iniziando da una singola plantula in coltura si può presumere la produzione di 1 milione di piante in 6 mesi. Per micropropagazione si intende la produzione di piante a partire da piccolissime parti di pianta, tessuti, o cellule allevate in ambiente asettico, ove possono essere rigorosamente controllati sia l’ambiente che la nutrizione. La micropropagazione consente di realizzare, nel corso dell’anno, un’attività continua (non dipendente dalle fasi stagionali come nella classica propagazione) con un programma di produzione più vicino alle esigenze di mercato. Conservazione di cloni per lunghi periodi (crioconservazione). Selezione e rapida moltiplicazione di cultivar nuove o migliorate, di materiale di fonte saggiato sanitariamente nei programmi di controllo delle malattie. IMPIEGHI

PROPAGAZIONE

Sterilizzazione Moltiplicazione Radicazione Ambientamento FASI DELLA MICROPROPAGAZIONE espianto

ESPIANTI VEGETATIVI coltura di meristemi apicali. Piccola parte dell’apice caulinare, esente da patogeni, si aggiungono solitamente citochinine a basse concentrazioni (ottima per erbacee, come orchidee; non funziona con legnose). Innesto apici caulinari. Per agrumi, melo e Prunus, vengono fatti microinnesti su piccolissimi apici caulinari. Vengono prodotte legnose virus-esenti. Ottimo per gli agrumi in quanto viene superata la lunga fase giovanile. Colture di apici caulinari. Simile alla propagazione per talea, si usa una talea caulina in miniatura. La buona riuscita dipende dall’espianto e dagli ormoni adatti. Metodo più esposto alla contaminazione di patogeni, ma manualmente semplice e veloce. La produzione di germogli ascellari può essere accompagnata dalla proliferazione di gemme avventizie dal callo alla base del propagulo, in tal caso la moltiplicazione può risultare accelerata. Sviluppo di germogli avventizi. Sia direttamente dall’espianto che indirettamente dal callo che si forma sulla superficie di taglio. I fattori che favoriscono lo sviluppo sono la scelta dell’espianto e il regime ormonale. Esempi di espianto: pezzi di foglia; espianti di apici di germogli (orchidee e felci); cotiledoni, ipocotili (conifere); giovani foglie (aghi); infiorescenze immature o scapi fiorali; scaglie di bulbi. La formazione diretta di tessuti inizia dalle cellule parenchimatiche che si trovano nell’epidermide o appena sotto, alcune di esse divengono meristematiche e formano gruppi detti meristemoidi. La reazione dell’espianto dipende dai livelli ormonali (bilanciamento tra auxine e citochinine). Lo sviluppo indiretto di germogli avventizi inizia con la produzione di un callo basale. I germogli si formano alla periferia del callo. Sistemi di coltura di tessuti e di cellule. La coltura di cellule vegetali sia come tessuto calloso, che come sospensione liquida è un importante tecnica preliminare alla rigenerazione dell’intera pianta. Tuttavia, a causa della possibile variabilità genetica insita nel sistema, questo tipo di coltura ha più significato nell’attività di miglioramento genetico.

ESPIANTI RIPRODUTTIVI Coltura di antere e polline. Questa tecnica assume importanza nel miglioramento genetico per la produzione di piante aploidi in cui i cromosomi vengono poi raddoppiati dando origine ad una linea omozigotica. Coltura di ovari (frutti) e ovuli (semi). Si ha la possibilità di produrre semi ibridi, il polline viene posto direttamente sulla placenta accanto all’ovulo. Embriocoltura. Gli embrioni sono asportati e fatti germinare su mezzo. Si possono salvare embrioni che sarebbero abortiti durante lo sviluppo su pianta. Può essere usata per rendere più pronta la germinazione di semi in dormienza e ridurre così il ciclo riproduttivo. L’asportazione dell’embrione elimina l’azione dei fattori che inducono dormienza, che hanno sede nei tegumenti seminali. Colture di semi.

La messa a punto di protocolli di propagazione in vitro prevedono la definizione di complessi equilibri di fattori fisici e chimici la cui regolazione costituisce un punto critico per l'ottenimento di elevate rese quantitative del materiale propagato. Un accurata definizione dei protocolli di micropropagazione, inoltre, consente di indurre capacità propagativa in specie e genotipi mostratisi recalcitranti con altri metodi propagativi. Es.: un meristema di lampone può produrre anche discendenti per mezzo della coltura in vitro, quando le tecniche classiche di propagazione ne forniscono soltanto 50 per anno. Si indirizza l’accrescimento e lo sviluppo attraverso il controllo ormonale (esercitato attraverso: il tipo di ormone, la concentrazione, la successione con cui vengono forniti). PROTOCOLLI

Vi sono otto principali gruppi di nutrienti necessari per la composizione di un terreno di coltura per le cellule vegetali: 1. Nutrienti inorganici principali - sono nutrienti che hanno ruoli funzionali e strutturali nelle cellule; sono presenti in quantità millimolari. Tra questi i principali sono l’azoto (come ammonio o nitrato); il fosforo (come fosfato); il potassio; lo zolfo (sotto forma di solfato); il calcio e il magnesio. 2. Microelementi - Sono generalmente presenti in quantità micromolari e includono manganese, zinco, boro, rame, cobalto e molibdeno; molti sono cofattori di importanti reazioni enzimatiche. 3. Ferro - è un importante cofattore che viene fornito in quantità millimolari in forma chelata (Fe- etilendiamminotetracetato o Fe-EDTA) in modo che l’elemento sia disponibile a pH> Vitamine - Le principali sono la tiamina, l’acido nicotinico, la piridossina, il mioinositolo, l’acido pantotenico, biotina, acido parabenzoico, colina, ed altre. Generalmente le vitamine sono cofattori enzimatici in reazioni del metabolismo primario. Tra questi la tiamina è essenziale per la crescita. 5. Carbonio - Generalmente i calli indifferenziati hanno poca o nulla attività fotosintetica, e sono fatti crescere al buio o con poca luce. E’ quindi necessario fornire loro una adeguata fonte di carbonio, in genere sotto forma di saccarosio (2-3%) o glucosio. 6. Azoto Organico - l’aggiunta di azoto organico in genere apporta dei benefici alla crescita del callo cellulare. 7. Regolatori di crescita - I livelli di regolatori di crescita sono il punto più critico nella composizione di un terreno di coltura. Le concentrazioni ottimali di auxine e citochinine differiscono a seconda dei casi. I più comuni regolatori sono naturali, come l’acido indolacetico (auxina), o la zeatina (citochinina), ma in genere si utilizzano auxine sintetiche, come il 2,4D (acido 2,4 diclorofenossiacetico), IBA (acido 3 indolbutirrico), NAA (acido 1 naftalen acetico) e citochinine sintetiche come la kinetina e BAP (6-benzilaminopurina) 8. Agar - per i terreni solidi si utilizza l’agar come agente gelificante a concentrazioni di 6-10 gr L -1. NUTRIENTI

SISTEMI DI RIGENERAZIONE L’accrescimento dell’apice meristematico interviene quando il meristema apicale di un’ estremità del germoglio viene fatto radicare per la produzione di una plantula. Tale procedura viene impiegata principalmente per ottenere piante esenti da virus, nelle quali solo il meristema apicale (0,5mm) è rimosso assieme a poche foglie sottostanti. I punti laterali di crescita sui nodi dell’espianto, sotto il meristema apicale, sono stimolati a crescere, mentre viene inibito il meristema apicale stesso. La crescita dei germogli ascellari provoca un processo di rapida moltiplicazione, nel quale il numero di piante potenziali, ad ogni ripetizione, aumenta esponenzialmente. Induzione diretta di germogli avventizi su radici, foglie, bulbi ed altri organi. Questi possono svilupparsi sia direttamente dall’espianto sia indirettamente da masse di tessuto calloso indifferenziato. L’organogenesi si riferisce alla produzione sia di germogli avventizi che di radici da cellule entro masse callose. Queste masse cellulari possono sviluppare meristemoidi che producono organi in particolari condizioni colturali. Cellule cresciute in coltura in sospensione, con particolari nutrienti e ormoni, possono sviluppare milioni di embrioni individuali. Queste strutture sono chiamate embrioni somatici.

ESPIANTO Si pone in coltura un espianto sterile. Fattori importanti: scelta dell’espianto, eliminazione inquinanti, nutrienti, luce, temperatura e substrato. In generale, tessuti giovani, come apici dei germogli terminali o laterali o avventizi hanno capacità rigenerative migliori. Ottime anche le gemme a fiore immature. La fase di impianto dura da 4 a 6 settimane, in questo tempo l’espianto si accresce producendo una piccola struttura fogliare con parecchie ramificazioni ascellari.

MOLTIPLICAZIONE Il materiale viene messo a crescere in presenza di elevati livelli di citochinina. Viene aumentato il numero di propaguli da far poi radicare allo stadio di plantule. La moltiplicazione dei germogli dipende o dalla continua formazione di germogli ascellari o dalla formazione di germogli avventizi dalle masse calliformi di tessuto alla base dei germogli.

RADICAZIONE I germogli della lunghezza di 20 mm vengono trattati con auxina così da stimolare la formazione delle radici.

AMBIENTAMENTO pesco pero In serra, periodo di acclimatazione, mezzo di radicamento areato e ben drenato.

Camera di coltura Cappe a flusso laminare

RISANAMENTO DA VIRUS I virus si possono trasmettere da pianta a pianta, per contatto, per seme, per polline, per propagazione vegetativa, per mezzo di funghi e per vettori animali. Non essendo le malattie virali curabili con trattamenti in campo, l'unico modo per controllarle rimane la prevenzione. Il risanamento di piante infette prevede la coltura di meristemi apicali, che si basa sul fatto che le particelle virali sono assai rare, o disturbate nel loro metabolismo nei meristemi apicali. Essa consiste nel prelevare un apice vegetativo ed allevarlo "in vitro“, in questo modo si otterrà l'intera pianta risanata ovviamente la sua condizione viene confermata da saggi virologici. COLTURA DI MERISTEMI APICALI

Vitis vinifera… Moltiplicazione Inizio coltura

…Vitis vinifera… Radicazione

…Vitis vinifera… Moltiplicazione

… Vitis vinifera Ambientamento

In alcuni casi si riscontra iperidricità dei tessuti e necrosi degli apici. Questi problemi possono essere risolti con la tecnica ad immersione temporanea che combina i vantaggi del terreno solido e liquido. T.I.LIQUID/SOLID IMMERSIONE TEMPORANEA

Con l’immersione temporanea il tasso di moltiplicazione è molto più alto rispetto a terreno solido o liquido. Inoltre le piante mostrano un migliore allungamento dello stelo. IMMERSIONE TEMPORANEA