“EARLY DETECTION” DI CONTAMINANTI FUNGINI TOSSIGENI SU SEMI DI CEREALI E LORO PRODOTTI DERIVATI ATTRAVERSO LA SPETTROSCOPIA DI IMMAGINE E ATTRAVERSO TECNICHE MOLECOLARI Antonella Del Fiore

 APPARTENENTI QUASI ESCLUSIVAMENTE AL GENERE A SPERGILLUS SEZ. FLAVI Aspergillus flavus. Aspergillus parasiticus, Aspergillus nomius  CONTAMINANTI PREFERENZIALI DI POST RACCOLTA CONDIZIONI DI CRESCITA Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus T= 19-42°C Topt=32°C U= 15-30% Aw minimo= 0,78 FUNGHI AFLATOSSIGENI TOSSINOGENESI T= 25-32°C Topt=28°C Aw minimo= 0,85

ISOLATE PER LA PRIMA VOLTA DA A.FLAVUS (1963) COMPOSTI ETEROCICLICI ALTAMENTE OSSIGENATI (Difurocumarociclopentenoni e difurocumarolattoni) ELEVATA ATTIVITA’ BIOLOGICA 17 AFLATOSSINE AD OGGI ISOLATE 4 PRINCIPALI AFLATOSSINE AFB 1, AFB 2, AFG 1, AFG 2 e AFM1 (derivante dalla AB 1 ) CARATTERISTICHE CHIMICO-FISICHE Basso peso molecolare Alto punto di fusione Stabilità alle alte temperature Scarsa idrosolubilità Fluorescenza naturale

SOGLIA MASSIMA DI ASSUNZIONE CON LA DIETA AFB1  EPATOCANCEROGENICITA’ AGENTE CANCEROGENO GRUPPO 1 (AIRC, 1993) LIVELLO PIÙ BASSO POSSIBILE ( AS LOW AS REASONABLE ACHIEVABLE, ALARA ). FEGATO ORGANO BERSAGLIO PRINCIPALE  EPATOTOSSICITA ’ AFM1  PROBABILE CANCEROGENICITA’ AGENTE CANCEROGENO GRUPPO 2  IMMUNOTOSSICITA’, GENOTOSSICITÀ

 MATRICI AD ALTO TENORE IN CARBOIDRATI O LIPIDI (SEMI OLEAGINOSI, SPEZIE, FRUTTA ESSICCATA E CEREALI)  MAIS CEREALE CONTAMINATO CON MAGGIORE FREQUENZA ELEVATO GRADO DI CONTAMINAZIONE AFB1 IN GRANELLA DI MAIS ELEVATO GRADO DI CONTAMINAZIONE AFM1 IN LATTE E DERIVATI CARRY OVER  FILIERA MAIDICOLA: NEL 2003 GRAVE PROBLEMA DI CONTAMINAZIONE DA AFLATOSSINE

AFLATOSSINA B1 AOAC /97 ISTISAN n.10 09/06/1999 AFLATOSSINE TOTALI METODI DI ANALISI UFFICIALI Reg.to CE 1881/2006 “Tenori massimi di micotossine nei prodotti alimentari” METODI CROMATOGRAFICI (HPLC) SISTEMA DI RILEVAZIONE FLUORIMETRICO  emissione = 440 nm)

INDIVIDUAZIONE PRECOCE DELLE SPECIE FUNGINE AFLATOSSIGENE RAPPRESENTA UNA DELLE STRATEGIE PIU’ EFFICACI PER LA PREVENZIONE ED IL CONTROLLO DELLA CONTAMINAZIONE DA AFLATOSSINE  MEDIANTE SPETTROSCOPIA D’IMMAGINE  MEDIANTE PCR (CLASSICA E REAL-TIME q-PCR) SVILUPPO DI METODICHE ANALITICHE PER IL “RILEVAMENTO PRECOCE” DI FUNGHI AFLATOSSIGENI ( Aspergillus spp. Sezione Flavi) IN MAIS

IBRIDI DI MAIS Zea mays L. FARINE COMMERCIALI CARATTERIZZAZIONE DEGLI ISOLATI A LIVELLO DI SPECIE CON CRITERI MORFOLOGICI E CON APPROCCIO SPETTRALE

TECNICA ANALITICA COMBINATA CARATTERIZZAZIONE PROPRIETA’ SPETTRALI CARATTERIZZAZIONE PROPRIETA’ DI “SUPERFICIE” TECNICA ANALITICA NON DISTRUTTIVA IMAGING S PETTROSCOPIA,

TIPICA CONFIGURAZIONE DI UN SISTEMA PER LA SPETTROSCOPIA D’IMMAGINE Pagina del software Spectral Scanner v. 2.0 DV s.r.l. (2003) per l’acquisizione e l’elaborazione delle immagini di riflettanza spettrale. PROVE SPERIMENTALI DESKTOP SPECTRAL SCANNER “ IMSPECTOR V10 ”-SPECIM TM, INTERVALLO SPETTRALE 400–1000 nm

RIFLETTANZA RELATIVA DEL CAMPIONE: RAPPORTO, IN OGNI PUNTO TRA IMMAGINE SPETTRALE DEL CAMPIONE E IMMAGINE SPETTRALE DEL BIANCO ACQUISIZIONE ED ARCHIVIAZIONE IMMAGINE SPETTRALE DEL CAMPIONE SELEZIONE SULL’IMMAGINE DELLA REGIONE DI INTERESSE (ROI) ELABORAZIONE SPETTRI DI RIFLETTANZA PER TUTTI I PUNTI DELL’AREA SELEZIONATA

1. ACQUISIZIONE ED ELABORAZIONE IMMAGINI SPETTRALI SPECIE FUNGINE ACQUISIZIONE ED ELABORAZIONE IMMAGINI SPETTRALI SPECIE FUNGINE 2. ACQUISIZIONE ED ELABORAZIONE IMMAGINI SPETTRALI DA MAIS NON CONTAMINATO ARTIFICIALMENTE NATURALMENTE CONTAMINATO ARTICOLAZIONE DELLE FASI DI RICERCA 3. ELABORAZIONE STATISTICA DEI DATI SPETTRALI VERIFICARE SE IL METODO ANALITICO RENDE POSSIBILE RILEVARE LA PRESENZA DI FUNGHI AFLATOSSIGENI IN MAIS SULLA BASE DI DIFFERENZE SPETTRALI SIN DALLE PRIMISSIME FASI DELLA CONTAMINAZIONE

Spettri registrati dopo 7 giorni di crescita a 30°C ACQUISIZIONE IMMAGINI SPETTRALI SPECIE FUNGINE CONTAMINANTI DEL MAIS PROFILI SPETTRALI DIFFERENTI TRA SPECIE FUNGINE DIFFERENTI ACQUISIZIONE DELLE IMMAGINI SPETTRALI DA MAIS PROFILI SPETTRALI DIFFERENTI DI DIFFERENTI SPECIE FUNGINE IBRIDI DI MAIS DIFFERENTI CARATTERIZZATI DA UGUALE PROFILO SPETTRALE

DIFFERENZE SPETTRALI SIGNIFICATIVE TRA MAIS AD ELEVATA DIFFERENZA DI COLORAZIONE (CECILIA/RED) (ANOVA -Fisher’s LSD test ) CECILIA CORNIOLA RED VALUTAZIONE DELL’ INFLUENZA SUL PROFILO SPETTRALE DEL MAIS DI:  GRADO DI UMIDITA’ (UA) DELLE CARIOSSIDI COLORAZIONE CARIOSSIDI  MICROFLORA NATURALE CARIOSSIDI INDIPENDENZA DEL SEGNALE SPETTRALE  dalla microflora naturale delle cariossidi  dal grado di umidita’ (UA) delle carIossidi FIRMA SPETTRALE “UNICA” DEL MAIS

ANALISI DELLE VARIAZIONI SPETTRALI DETERMINATE DALLO SVILUPPO FUNGINO SULLA SUPERFICIE DEL MAIS ACQUISIZIONE ED ANALISI SPETTRI DI MAIS CONTAMINATO ARTIFICIALMENTE IN CONDIZIONI DI INOCULO CONTROLLATO A.niger A.flavus ATTRAVERSO MAIS C.V. CECILIA 30% UA, 0,99 A W INOCULO SOSPENSIONE CONIDICA FUNGHI (100 conidi *g- 1 mais) ACQUISIZIONE GIORNALIERA  t 10 GIORNI

RISULTATI Spettri medi di assorbanza apparentedi mais inoculato con singole specie fungine, a 1, 2, 3 e 7 giorni dall’inoculo su mais. Per tutti i campioni analizzati, e per tutte le specie fungine testate DUE INTERVALLI DI LUNGHEZZA D’ONDA, nm e nm (Pearson et al., 2006) Spettri medi di assorbanza apparente di mais inoculato con singole specie fungine a 1, 2, 3 e 7 giorni dall’inoculo su mais.

 nm: ASSORBANZA MAIS INOCULATO > RISPETTO AL MAIS NON INOCULATO  nm: ASSORBANZA MAIS INOCULATO < RISPETTO AL MAIS NON INOCULATO

Spettri medi di assorbanza apparente di mais inoculato con differenti specie fungine registrati a 3 giorni dall’inoculo su mais  Variazioni spettrali in mais contaminato con Aspergillus niger maggiori rispetto a quello contaminato con Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus  Andamento caratteristico mais inoculato con Aspergillus niger con punto di flesso a 535 nm 535 nm

 48 h di infezione a 410 nm e 470 nm (PCA+ ANOVA, Fisher’s LSD test, livello di confidenza del 95%) ELABORAZIONE STATISTICA DEI DATI SPETTRALI 72 h di infezione ( PCA+ DA, livello di confidenza del 95%) DIFFERENZE SPETTTRALI STATISTICAMENTE SIGNIFICATIVE TRA IL MAIS NON CONTAMINATO ED IL MAIS CONTAMINATO CON ASPERGILLUS FLAVUS A PARTIRE DA: Il metodo permette di rilevare la presenza di Aspergillus flavus a 48 h dall’inoculo su mais, prima che il fungo diventi evidente ad osservazione visiva

METODO ANALITICO BASATO SULLA SPETTROSCOPIA D’IMMAGINE  UTILIZZABILE COME METODO DI RICONOSCIMENTO FUNGINO “ SPECTRAL MATCHING” TRA SPECIE FUNGINE CON PROFILI SPETTRALI NOTI E SPECIE FUNGINE INCOGNITE  METODO RAPIDO E SUFFICIENTEMENTE SENSIBILE PERMETTE DI RILEVARE LA CONTAMINAZIONE FUNGINA A 48 h dall’infezione

SVILUPPATE METODICHE BIOMOLECOLARI BASATE SULLA PCR PER IL RILEVAMENTO DI FUNGHI AFLATOSSIGENI IMPIEGO DI MARCATORI MOLECOLARI SPECIFICI GENI TARGET COINVOLTI NELLA VIA BIOSINTETICA DELLE AFLATOSSINE Metodica semiquantitativa basata sulla PCR CLASSICA Metodica quantitativa basata sulla REAL-TIME qPCR PERMETTONO DI RILEVARE LA PRESENZA DI SPECIE FUNGINE POTENZIALMENTE AFLATOSSIGENE Afl P Afl M Afl R

Amplificazione PCR di DNA estratto, a tempi differenti di infezione, da matrice contaminata artificialmente con inoculo minimo di una sospensione conidica del fungo di interesse 2.a.DNA TOTALE ESTRATTO DA MATRICE CONTAMINATA ARTIFICIALMENTE IN CONDIZIONI DI INOCULO CONTROLLATO SPECIFICITA’ Verificata testando la coppia di primer scelta per l’amplificazione del frammento genico di interesse con DNA estratto da differenti specie fungine SENSIBILITA’ “Quantita’ minima di DNA fungino rilevabile” Determinata amplificando con i primer selezionati diluizioni seriali di DNA genomico della specie fungina di interesse Curva standard per analisi semiquantitativa 1.SVILUPPO DEL PROTOCOLLO DI AMPLIFICAZIONE CON DNA FUNGINO PUROSVILUPPO DEL PROTOCOLLO DI AMPLIFICAZIONE CON DNA FUNGINO PURO  VALUTAZIONE DELLA SPECIFICITA’ E DELLA SENSIBILITA’ DEL METODO VALUTAZIONE DELLA SPECIFICITA’ E DELLA SENSIBILITA’ DEL METODO SVILUPPO DEL METODO MOLECOLARE ”PCR E REAL TIME qPCR” 2.b. DNA TOTALE ESTRATTO DA MATRICE NATURALMENTE CONTAMINATA 2.VERIFICA DELLA SPECIFICITA’, SENSIBILITA’ E FATTIBILITA’ DEL METODO SU MATRICE REALE APPLICAZIONE DEL PROTOCOLLO DI AMPLIFICAZIONE A MATRICE NON CONTAMINATA ARTIFICIALMENTE (MATRICE T.Q) CONFERMA DELLA EFFICACIA DEL METODO ATRAVERSO PROVE DI ISOLAMENTO MICOTICO TRADIZIONALI VERIFICA DELLE PROPRIETA’ DI “EARLY DETECTION” DEL METODO DETERMINAZIONE DELLA CAPACITA’ DEL METODO DI MONITORARE LO SVILUPPO DEL FUNGO SU MATRICE E PERMETTERNE LA RILEVAZIONE FIN DALLE PRIME FASI DELLA CONTAMINAZIONE

VERIFICATA SOTTOPONENDO AD AMPLIFICAZIONE PER PCR DNA ESTRATTO DA: A. flavus A. parasiticus Gel Agarosio 1% PCR di DNA estratto da micelio fungino da colture pure  FUNGHI ASPERGILLUS SEZIONE FLAVI (Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus)  ALTRI FUNGHI ASPERGILLUS ( Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger )  FUNGHI NON ASPERGILLUS ( Fusarium sp., Rhizopus sp. )  BIOMASSE FUNGINE MISTE AMPLIFICAZIONE ESCLUSIVA CON DNA DI A. FLAVUS E A. PARASITICUS

IL FUNGO A 12 h DALL’INOCULO SU MAIS NON E’ ANCORA RILEVABILE AD OSSERVAZIONE ALLO STEREOMICROSOPIO QUANTITA’ MINIMA RILEVABILE DI DNA DI A.FLAVUS 10 pg IL METODO PERMETTE QUINDI IL RILEVAMENTO “PRECOCE” DI ASPERGILLUS FLAVUS SU MAIS INTERVALLO (100 ng-5pg) CURVA STANDARD DNA GENOMICO DI A.FLAVUS 3357 LIMITE DI RILEVABILITA’: 12 h dopo inoculo con 100 conidi MONITORAGGIO DELLO SVILUPPO DI A. FLAVUS SU MAIS GENE TARGET Afl M

IDENTIFICAZIONE CERTA DELLA SEQUENZA TARGET RISPETTO A PRODOTTI ASPECIFICI ( Curve di melting ) AMPLIFICAZIONE SEQUENZA TARGET E CONTEMPORANEA QUANTIFICAZIONE PER MEZZO DI UN DETECTOR A FLUORESCENZA SVILUPPATO UN METODO PER IL RILEVAMENTO QUANTITATIVO DI FUNGHI ASPERGILLUS spp. SEZIONE FLAVI SU MAIS ATTRAVERSO REAL-TIME qPCR (Colorante Sybr-green) Gene target: Afl R Frammento amplificato: 352 bp

DNA DILUIZIONI SERIALI STANDARD DNA PLASMIDICO GENE aflR INTERVALLO ( ) pg, CURVA STANDARD DNA PLASMIDICO A. FLAVUS QUANTITA’ MINIMA DNA FUNGINO RILEVABILE pg MONITORAGGIO DELLO SVILUPPO FUNGINO SU MAIS LIMITE DI RILEVABILITA’ 6 h  IL METODO PERMETTE DI RILEVARE QUANTITA’ DI DNA DI FUNGHI AFLATOSSIGENI 10 4 VOLTE INFERIORI A QUELLE DELLA PCR TRADIZIONALE IL DNA FUNGINO SU MAIS E’ RILEVATO E QUANTIFICATO DOPO SOLE 6 h DALL’INOCULO RISPETTO ALLE 12 h DELLA PCR CLASSICA Gene target Afl R

CONFERMA DEL METODO SU MATRICE NATURALMENTE CONTAMINATA GLI IBRIDI A MINORE CONCENTRAZIONE DI DNA FUNGINO NON HANNO INVECE EVIDENZIATO SVILUPPO DI A.FLAVUS NEI PRIMI 7 GIORNI  Min: ( 0,122 pg/gmais) DKC 6843  Max: ( pg/g mais) SIV SVILUPPO EVIDENTE MICELIO A. FLAVUS DOPO 4 GIORNI SU IBRIDI A PIU’ ALTA CONCENTRAZIONE IN DNA FUNGINO < 0,001mg micelio 4,12 mg micelio DETERMINAZIONE E QUANTIFICAZIONE DI DNA DI ASPERGILLUS FLAVUS IN MAIS E FARINE COMMERCIALI NON CONTAMINATI ARTIFICIALMENTE DKC 6843

 METODICA SEMIQUANTITATIVA MEDIANTE PCR CLASSICA “Primer per afl P e afl M ”  rilevabilità della contaminazione da Aspergillus flavus dopo 12 h METODO DI “EARLY DETECTION” MOLECOLARE  METODICA QUANTITATIVA MEDIANTE REAL-TIME qPCR “Primer per afl R ”  rilevabilità della contaminazione da Aspergillus flavus dopo 6 h  ELEVATA SPECIFICITA’ E SENSIBILITA’

 RAPIDITA’ DI ESECUZIONE  RILEVAZIONE PRECOCE DI BASSI LIVELLI DI CONTAMINAZIONE FUNGINA  SVILUPPO DI SISTEMI PORTATILI O AUTOMATIZZATI PER DETERMINAZONI “IN SITU”O ON-LINE (SPETTROSCOPIA D’IMMAGINE)  METODI ANALITICI AFFIDABILI E SENSIBILI  RIDUZIONE DELL’IMMISSIONE NELLE FILIERE AGROALIMENTARI DI SOSTANZE CARCINOGENE