Proteomics: the global analysis of proteins

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1 Chap. 7 Response of First-Order RL and RC Circuits Contents 7.1 The Natural Response of an RL Circuit 7.2 The Natural Response of an RC Circuit 7.3 The.
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Proteomics: the global analysis of proteins 1

2

SDS polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE gel) 3

Western blotting can detect the specificity protein detect one protein in a mixture of any number of proteins.

Method (1) Proteins are separated by gel electrophoresis

(2) The proteins are transferred to membrane (nitrocellulose or PVDF)

Western blotimg 7

(3)blocking (4)add primary antibody (5)add labeled secondary antibody (enzyme .Fluorophore….)

9

Gold nanoparticels ?

two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis 12

13

Sanger’s法(Sanger’s method) 1945年   蛋白質或胜肽的胺基末端決定方法 51 residues 100g >10 years

Edman切割法(Edman degradation)   可能是目前蛋白質序列分析中,最重要的技術 蛋白質胜肽定序儀(Protein peptide sequenator)   自動化分析蛋白質的序列

Mass spectrometry matrix-assisted laser desorption-ionization (MALDI) and time-of-flight (TOF) 19

MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption inoization- time of flight MS本身有三個主要部份 第一個部份是來源(source),由樣品產生離子;第二個部份是質析(mass analyzer),依離子質量/價數【mass/charge(m/z)】的比例分開它們;第三個部份是偵測(detector),也就是mass analyzer的結果。

MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption inoization- time of flight 將待測物peptides與matrix混合,matrix中的微小分子,會吸收特殊波長的光。source這兒提供雷射光,matrix吸收光子而激發電子,釋放的能量轉到sample中的peptide上,離開matrix表面進入空氣中。這樣的離子化過程,依樣品的性質,產生正離子或負離子,正離子的產生是在脫離matrix的過程中,接受了質子所致。每一個peptide分子會接受單一的質子,因此,大部份的peptide離子都會帶一個正電。在MALDI形成這樣的離子後,再送入TOF mass analyzer分析。

MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption inoization- time of flight TOF(time of flight),能測得離子由analyzer一端到另一端(detector)的時間,m/z值愈大,時間愈短。MS的優劣是在於能區別離子間微小m/z的差異,但是這種測量直線行進速度的TOF解析力不夠高,造成直線型TOF低解析力的原因,在於相同m/z值的離子,直線行進速度也有快慢之別。

MALDI-TOF MS 優點 第一,操作簡便,是所有MS中最容易學會的一種,可以在一天之內分析上百件樣品。 第二,需要大量製備蛋白質樣品的地方,目前從2D 電泳膠體的製作、蛋白質點(protein spots)的取出及酵素水解,都採用自動化的設備,MALDI-TOP也能以這樣的形式存在,減少人力、提高效率。 第三,隨著TOF分析方式的改良,得到的蛋白質體數據也愈正確。 第四,MALDI-TOF MS的靈敏度高,可以偵測到少量的(可到10-18 mole)蛋白質。

MALDI-TOF MS 缺點 第一,MALDI-TOF MS可以提供正確的「質量(mass)」資訊,卻不能獲得詳細的「序列(sequence data)」結果。 第二,分析的成敗,幾乎取決於樣品製備的品質,如果樣品在水解過程被金屬、鹽類、尿素、丙醇污染,或是界面活性劑(detergen)沒有去除乾淨,都會使樣品在MALDI source的電離(ionization)受到極大的影響。MALDI-TOF MS對此特別敏感。

檢測流程 LCM (Laser Capture Microdissection)