Tomoki Ito Immunity 28, 870-880, June 2008 Two functional subsets of FOXP3+ Regulatory T cells in human thymus and periphery Tomoki Ito Immunity 28, 870-880, June 2008

Treg CD4+CD25+ naturally occurring Treg: - Active suppression of autoimmunity in human and rodents - Develop from CD4+CD8+ DP or CD4+CD8- SP in thymus Signal through TCR from medium to high affinity for self-antigens, IL-2, CD28 FOXP3: forkhead transcriptional-factor family: critical regulator of Treg cell development IL-10 and TGFβ involved in Treg cell-mediated immunosuppression?  * CD4+FOXP3-IL-10-(Tr1): during immune response in periphery * TGFβ-expressing Th3: oral tolerance induction to myelin basic protein * naturally occuring FOXP3+ Treg: in thymus

Naïve T CD4+ Th1 Th2 Th17 : pathogenic Treg Th17 Th17 : nonpathogenic IL-17A IL-23 IFNr, IL-12, IL-27 Naïve T CD4+ Th1 T-bet, STAT4, IRF1 IFNr IL-4, IL-25 IL-12 TGF-b +Il-6 (IL-1B, IL-18, TNF-a) GATA-3, c-maf, Jun B TGF-b_ IL-2) Th2 +Retinoic acid: Anti-Inflammatory Response Inflammatory Rsponse IFNr, Il-2, IL-4, IL-12, Il-27 RORrt, STAT3, IRF4 -Retinoic acid: Pro-inflammatory response IL-4 IL-5 IL-13 IL-25 IL-31 IL-33 IL-6 Proinflamatory cytokines Th17 : pathogenic Promotes Autoimmune Disease IL-17A, F, A/F IL-21 IL-22 IL-26 CCL20 IL-23 Treg Th17 IL-10 FOXP3 Prevents Autoimmune Disease Th17 : nonpathogenic /regulatory TGF-b+IL-6 TGF-b IL-10 IL-17 IL-10, IL-17A, F, A/F

ICOS http://www.ebioscience.com/ebioscience/whatsnew/costim_files/costim.JPG

Identification of ICOS+ and ICOS-FOXP3+ Treg cells in human thymus FOxP3+ Treg in thymic medulla ICOS+와 ICOS-로 나눠지는 것을 봄 (FOXP3-red, ICOS-A-blue B-green)

ICOS를 통해 CD4+ T cell이 prime 되면 IL-10 분비하게 되므로 두 가지 subset이 기능적으로 다른지 알아보기 위해 CD25+ICOS+ CD25+ICOS- 두 가지 subset 다 CD4+CD25- T cell Prolifertion을 억제함 * *

ICOS+FOXP3+ and ICOS-FOXP3+ Treg cells in peripheral lymphoid tissues and blood 두 가지 subset이 thymus를 벗어나 periphery로 가는지 봄: 인간의 편도선과 림프절의 T-cell rich, subepithelial cell region 에 두 subset이 존재하였다 (GC에는 ICOS+ fTh cell이 많이 있지만 FOXP3는 적게 발현함) FOXP3-red ICOS-blue

CD25+ICOS+ 4.02% 3.59% 2.56% 2.45% CD25+ICOS-

x x x x x x x x CD127: IL-7Rα CRTH2: marker for Th2 memory cells CD57: marker for follicular T helper cells x x x x x x x x

Human adult blood에는 2가지 FOXP3+ Treg의 두가지 population이 있다고 함 CD45RA+ naïve phenotype  human cord blood의 FOXP3+ Treg의 대부분을 차지 CD45RO+ memory phenotype 두 가지 ICOS subset에도 적용되는지 알아보기위해 CD45RA, CD45RO 발현을 각각 adult blood, cord blood에서 봄 CD45RO+CD45RAlow memory 50% 100% CD45RA+ naïve phenotype 두 가지 subset의 FOXP3+CD31+ recent thymic emigrants와의 관계를 보기 위해 두 가지 subset이 다 recent thymic emigrant를 가짐. Adult에서는 CD31발현이 적은 것을 보아 Thymic output이 현저히 감소

The ICOS+FOXP3+ Treg cells have the ability to produce the high amount of IL-10 두 가지 Treg subset의 cytokine production이 비슷한지 봄 방법: PMA + Iono 6시간 or anti-CD3+ anti CD28 24시간 activation해서 IL-10, IL-2생산 봄 by Facs, ELISA Facs – intracellular cytokine staining ELISA CD25+ICOS+: IL-10을 4배 더 분비 Naïve, memory T cell이 Treg보다 IL-2를 더 많이 분비

Anti-CD3 or anti-CD3+ICOSL으로 5일 activation  Treg cell의 cytokine 분비 봄 Facs – intracellular cytokine staining ELISA Treg이 stimulation전보다 Il-2를 더 분비하지만 여전히 T cell보다는 적다 ICOS+가 47-76% IL-10생산 ICOS-가 8-16% IL-10생산

ICOS+FOXP3+ Treg이 다른 CD4+ T cell subset보다 IL-10 더 분비하나?  CD45RO+ memory T cell 의 모든 subset에서 IL-10분비 봄 CD45RO+ICOS+ memory cell이 IL-10을 가장 많이 분비 5 day priming  ICOS+ Treg이 IL-10을 가장 많이 분비 ⇒ circulating CD4+ T cell pool에서 가장 많이 IL-10분비

The ICOS-FOXp3+ Treg cells express greater amounts of TGFβ than other CD4+ T cells TGFβ가 FOXP3+Treg의 immunosuppression에 가장 중요한 분자임!  Activation 후 mTGFβ의 발현을 봄 Quantative RT-PCR로 TGFβ의 mRNA 발현 정도 확인 CD4+CD25+FOXP3+ natural Treg이 2가지 subset으로 나눠지는 것 확인

ICOS+FOCp3+ and ICOS-FOXp3+ Treg cells use different molecular mechanisms for suppression 두가지 subset이 다른 기능할까? A. CD4+CD45RO-CD25- naïve T cell이 Allogeneic DC와 culture 됐을 때 ICOS+Treg, ICOS-Treg에 의해 Proliferation 저해 받는다 B.ICOS+: αIL-10, αTGFβ –각기 조금 inhibition block… 둘 다 쓰면 완전히 block ICOS- Treg은 αTGFβ inhibitor만 써도 function이 block됨  cell-cell contact suppression !

ICOS+는 mTGFβ와 soluble IL-10 Suppression을 둘 다 이용 DC의 CD86발현이 ICOS+ Treg에 의해 저해된다.. αIL-10으로 회복됨 ICOS+Treg은 DC성숙을 막기 위해 IL-10을 이용 Transwell system에 의해 ICOS-Treg function이 막힘

Survival and preoliferation of -ICOS+FOXP3+ and ICOS-FOXP3+ Treg cells are differently regulated Peripheral ICOS+Treg과 ICOS-Treg의 survival, expansion이 다르게 조절되나? ICOS+는 ICOS신 호 없으면 IL-2에 의해 apotosis를 많이 일으킴 IL-2 culture for 5 days ICOS-: ICOS, anti CD28에 의한 proliferation ICOS+: ICOS에 의한 proliferation 다른 costimulatory molecule에 의해 survival, proliferation조절됨

Plasmacytoid DCs but not myeloid DCs promote the proliferation of ICOS+ Treg Cells through ICOSL Plasmacytoid DC(pDC): ICOSL을 발현 ….after activation Myeloid DC(mDC): CD80, CD86을 발현 mDC는 naïve CD4+를 prime해서 IL-10을 분비하는 cell로 분화하게 함 pDC와 mDC가 두 Treg subset의 proliferation을 다르게 조절하나? *pDC는 ICOS+Treg의 proliferation 조절 *mDC는 ICOS-Treg의 proliferation조절

Summary Identification of naturally occurring FOXP3+ Treg cells 의 two subsets: * ICOS+FOXP3+: -use IL-10 to suppress dendritic cell (DC) function and TGF-b to suppress T cell function -survival signal through ICOS Tr1 * ICOS-FOXP3+: -use TGF-b mainly -survival signal through CD28 Th3