Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Bioethanol Kevin A Gray, Lishan Zhao and Mark Emptage 강 현 우강 현 우 창해 연구소 수습 사원 Current Opinion in Chemical Biology Volume 10, Issue 2Current Opinion in Chemical Biology Volume 10, Issue 2, April 2006, Pages

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Introduction Thermochemical pretreatment Enzymatic depolymerization of cellulose and hemicellulose Cellulase engineering Enzyme–substrate interaction Hemicellulases Hexose and pentose fermentation Conclusions References Contents

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Introduction 현재 미국의 crude oil 매일 소비량 : 2 천만 barrels ( 그 중 60% 수입 ) US Energy Policy Act of 2005 ( 에서 오일산업은 2012 년까지 7.5 billion gal 의 renewable fuels 를 섞어 사용할 것을 요구. 또한 많은 주들이 E10 and E20 의 사용과 같은 renewable fuels standards 를 통과. 지금까지 가장 흔한 renewable fuels 는 에탄올이고, 미국에서 최근 연간 생산량이 4 billion gal 을 넘어서고 있다. 미국에서 에탄올 생산을 위한 주요한 자원은 corn grain (stach). 미국은 오직 옥수수로 부터 연간 13 billion gal 을 제공할 capacity 를 가지고 있고, 목표했던 7.5 billion gal 은 생각보다 빨리 도달할 것. 그러나 에탄올 생산의 증대는 공급의 제한성으로 인해 옥수수보다 다른 공급원 으로 인해 이루어 질 것이다.

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Biomass 의 구성 Cellulose (40-50%) Hemicellulose (25-35%) Lignin(15-20%) Introduction Starch -  -1,4 &  -1,6 결합 (amylose, amylopectin) VS VS Cellulose -  -1,4 결합 (crystalline, compact, resistant) Hemicellulose - xylane bacbone(  -1,4 결합 ) 에 mannose, arabinose, galactose, glucuronic acid, etc 의 가지결합 Lignin Lignin - hemicellulose 에 ferulic acid ester linkages 로 공유결합

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Figure 1. Schematic of the basic structure of hemicellulose. A, arabinose; FeA, ferulic acid; G, galactose; Glc, glucuronic acid; X, xylose. Introduction -> 이러한 복잡하고 밀집된 구조로 인해 starch 보다 발효성 당으로의 효소적 분해는 어렵고, 에탄올로의 전환 비용은 더 많이 든다.

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Figure 2. Schematic of biomass and starch processing that could occur in a biorefinery. In this review first, 열화학적 전처리단계 second, 효소적 당화 (cellulase, hemicellulase) thirdly, 특화된 미생물을 이용한 발효

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Thermochemical pretreatment 천연의 아무런 처리가 되지 않은 biomass 는 효소적 소화가 극히 힘들다. 그러므로, 여러가지 전처리 공정은 분해력을 향상시키기 위해 개발되어왔다. 전처리 공정은 식물의 세포벽을 허물고, 효소가 다당류에 잘 접근할 수 있도록 돕는다. hemicellulose 와 lignin 의 제거와 cellulose 의 분해능력 사이의 직접적인 연관성에 관한 연구 전처리 공정에 사용되는 화학약품은 강산에서 약산까지 다양 -> 각 biomass 의 주요 구성 성분에 따라 다양하게 영향 77 C.E. Wyman, B.E. Dale, R.T. Elander, M. Holtzapple, M.R. Ladisch and Y.Y. Lee, Coordinated development of leading biomass pretreatment technologies, Bioresour Technol 96 (2005), pp. 1959– S. Kim and M.T. Holtzapple, Effect of structural features on enzyme digestibility of corn stover, Bioresour Technol 97 (2006), pp. 583– C. Liu and C.E. Wyman, Partial flow of compressed-hot water through corn stover to enhance hemicellulose sugar recovery and enzymatic digestibility of cellulose, Bioresour Technol 96 (2005), pp. 1978– T.A. Lloyd and C.E. Wyman, Combined sugar yields for dilute sulfuric acid pretreatment of corn stover followed by enzymatic hydrolysis of the remaining solids, Bioresour Technol 96 (2005), pp. 1967– N. Mosier, R. Hendrickson, N. Ho, M. Sedlak and M.R. Ladisch, Optimization of pH controlled liquid hot water pretreatment of corn stover, Bioresour Technol 96 (2005), pp. 1986–1993.

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Thermochemical pretreatment 전처리공정의 화학약품들은 가수분해물의 당 이외의 물질에도 영향을 미친다. 예를들어, 산성물질들은 액상에 furfural 의 농축을 야기하고, 반면 염기성 물질들은 가수분해물 내에 ferulate 와 acetate 의 농축을 야기할 수 있다. 이러한 물질들은 발효시 저해물질로 작용 이러한 전처리 공정에 대한 경제적 분석 전처리 공정에 대한 몇몇 전략들 1515 T. Eggeman and R.T. Elander, Process and economic analysis of pretreatment technologies, Bioresour Technol 96 (2005), pp. 2019– N. Mosier, C. Wyman, B. Dale, R. Elander, Y.Y. Lee, M. Holtzapple and M. Ladisch, Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass, Bioresour Technol 96 (2005), pp. 673– C.E. Wyman, B.E. Dale, R.T. Elander, M. Holtzapple, M.R. Ladisch and Y.Y. Lee, Comparative sugar recovery data from laboratory scale application of leading pretreatment technologies to corn stover, Bioresour Technol 96 (2005), pp. 2026–2032.

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Enzymatic depolymerization of cellulose and hemicellulose Cellulase – 세가지 타입의 효소로 구성 Hemicellulase – 다양한 종류의 효소로 구성 1. endoglucanases (EC ), which cleave internal β-1,4-glucosidic bonds; 2. exoglucanases (EC ), which processively act on the reducing and non-reducing ends of cellulose chains to release short-chain cello-oligosaccharides; 3. β-glucosidases (EC ), which hydrolyze soluble cellooligosaccharides (e.g. cellobiose) to glucose. 1. β-1,4-xylan (xylanases EC , β-xylosidases EC ) 2. various side chains (α-l-arabinofuranosidases EC , α-glucuronidases EC , acetyl xylan esterases EC , ferulic acid esterases EC , α-galactosidases EC )

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Enzymatic depolymerization of cellulose and hemicellulose Complexed system – cellulosome ; 혐기성 미생물이나 곰팡이류에서 존재, 호기성 미생물의 경우 별개의 효소를 배출하는 경향 지금까지 이러한 효소들은 박테리아나 곰팡이류에서 분리, 또는 미생물을 이용한 cellulase 생산 생산 경비 절감 - T. reesei cellulases 의 10 배 이상의 단가 감소 -> 효소 자체의 engineering 이나 생산기술의 개발로 지속적인 cost 감소가 필요 A.L. Demain, M. Newcomb and J.H.D. Wu, Cellulase, clostridia, and ethanol, Microbiol Mol Biol Rev 69 (2005), pp. 124– R.H. Doi and A. Kosugi, Cellulosomes: plant-cell-wall-degrading enzyme complexes, Nat Rev Microbiol 2 (2004), pp. 541– L.R. Lynd, W.H. van Zyl, J.E. McBride and M. Laser, Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass: an update, Curr Opin Biotechnol 16 (2005), pp. 577– D. Greer, Spinning straw into fuel, Biocycle 46 (2005), pp. 61–65.

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Cellulase engineering Cellulase 의 효소 능력의 향상이나 효소의 사용량을 줄이기 위한 몇몇 시도가 계속되어 옴. 그 첫 시도가 cellobiohydrolase 임 - 일반적인 cellulase system 의 60-80% 를 차지. ; Teter et al. [27 ] - combination of site-directed mutagenesis, site-saturation mutagenesis,27 error-prone PCR and DNA shuffling 을 이용하여 T. reesei Cel7A 의 변이체 제조. : thermal stability 와 thermal activity 향상. Day et al. [28] - site-directed mutagenesis 를 이용하여28 우수한 Hypocrea jecorena cellobiohydrolase Cel7A (CBH1) variants 발견. : thermostability 와 reversibility 향상. Bower [29] - fusion protein (Acidothermus cellulolyticus 로부터 GH5A 를 T. reesei cellobiohydrolase29 CBH1 에 연결 -> 전처리 후 당화시 효과적 Bower BS (Genencor International IU): Fusion proteins of an exocellobiohydrolase and an endoglucanase for use in the saccharification of cellulose and hemicellulose patent Teter S, Cherry J, Ward C, Jones A, Harris P, Yi J (Novozymes Biotech IU): Variants of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei with improved properties. 2004, Day AG (Genencor International IU): Novel variant Hypocrea jecorina CBH I cellulases, their production with recombinant cells, and their uses. 2003, patent

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Enzyme–substrate interaction Cellulase 는 종종 기질과 효소 사이의 interaction 을 매개하는 carbohydrate-binding modules (CBMs) 을 포함 -> 이것이 기질과의 친화력이나 선택성을 향상시키는 타켓 CBMs 의 구조에서의 미묘한 차이가 매우 다른 ligand specificity 를 야기할 수 있다.[32 ].32 Lignin – 가수분해물에 존재함으로 cellulase 를 불활성화 시키거나 비 생산적 결합 유도 ; Berlin et al. [35] - lignocellulosic hydrolysis 에 대해서 cellulases 의 activity 를 향상 시키는 새로운35 접근법 ; weak lignin-binding enzymes 을 사용하여 결과적으로 활성증가. Palonen [36] - location and structure of lignin 가 lignin 의 총량보다 효소적 가수분해에 영향을36 미치는 결정적 인자임을 밝힘 A.B. Boraston, D.N. Bolam, H.J. Gilbert and G.J. Davies, Carbohydrate-binding modules: fine-tuning polysaccharide recognition, Biochem J 382 (2004), pp. 769– A. Berlin, N. Gilkes, A. Kurabi, R. Bura, M. Tu, D. Kilburn and J. Saddler, Weak lignin-binding enzymes. A novel approach to improve activity of cellulases for hydrolysis of lignocellulosics, Appl Biochem Biotechnol (2005), pp. 163– H. Palonen, Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose, VTT Publications 520 (2004), pp. 1–80.

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Hemicellulases Hemicellulase 의 효과적인 분해는 여러 효소들의 시너지 효과를 요구. 더 중요한 것은 hemicellulase 가 cellulose 의 가수분해를 매개. -> cellulose fiber 의 노출, 접근성 향상. 그러나, 일반적으로 산을 이용한 전처리 과정에서 당화전에 hemicellulose 는 제거 되므로 cellulose 에 비해 관심도 적었고, 개발도 미미. -> 산처리 없는 전처리 공정을 이용시엔 hemicellolose 가 남아 hemicellulase 가 요구 지난 몇 년 사이에는 hemicellulase 에 대한 연구 진행 ; xylanase 의 구조와 기능에 대한 연구, 효소적 특이성에 관한 연구, hemicellulase CBMs 연구 바이오에탄올 생산을 위한 단가를 낮추기 위해 상업적인 hemicellulose 의 단가 하락을 위한 개발도 앞으론 필요 3737 S. Kaneko, H. Ichinose, Z. Fujimoto, A. Kuno, K. Yura, M. Go, H. Mizuno, I. Kusakabe and H. Kobayashi, Structure and function of a family 10 β-xylanase chimera of Streptomyces olivaceoviridis E-86 FXYN and Cellulomonas fimi cex, J Biol Chem 279 (2004), pp – G. Pell, L. Szabo, S.J. Charnock, H. Xie, T.M. Gloster, G.J. Davies and H.J. Gilbert, Structural and biochemical analysis of Cellvibrio japonicus xylanase 10C: how variation in substrate-binding cleft influences the catalytic profile of family GH-10 xylanases, J Biol Chem 279 (2004), pp – G. Pell, E.J. Taylor, T.M. Gloster, J.P. Turkenburg, C.M.G.A. Fontes, L.M.A. Ferreira, T. Nagy, S.J. Clark, G.J. Davies and H.J. Gilbert, The mechanisms by which family 10 glycoside hydrolases bind decorated substrates, J Biol Chem 279 (2004), pp. 9597– M. Vardakou, J. Flint, P. Christakopoulos, R.J. Lewis, H.J. Gilbert and J.W. Murray, A family 10 thermoascus aurantiacus xylanase utilizes arabinose decorations of xylan as significant substrate specificity determinants, J Mol Biol 352 (2005), pp. 1060– A. Levasseur, D. Navarro, P.J. Punt, J.P. Belaich, M. Asther and E. Record, Construction of engineered bifunctional enzymes and their overproduction in Aspergillus niger for improved enzymatic tools to degrade agricultural by-products, Appl Environ Microbiol 71 (2005), pp. 8132– Y. Lin and S. Tanaka, Ethanol fermentation

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Hexose and pentose fermentation Biomass 로 부터의 당은 hexose 와 pentose 의 혼합물. - 대부분의 야생 효모는 pentose ( 주로 xylose) 를 대사하지 못하므로 에탄올 수율이 떨어짐. Gene manipulation 과 metabolic engineering 을 이용한 개량균주의 개발 시도. - pentose 를 대사할 수 있는 효모 개발 - 에탄올 수율을 향상시킬수 있는 균주 개발 - pentose, hexose 둘다 대사할 수 있는 균주 개발 - 가수분해물 내의 저해제들에 대한 내성을 가진 균주 개발 - Zymomonas mobilis 의 이용과 균주 개량 4242 Y. Lin and S. Tanaka, Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects, Appl Microbiol Biotechnol 69 (2005) B.S. Dien, M.A. Cotta and T.W. Jeffries, Bacteria engineered for fuel ethanol production: current status, Appl Microbiol Biotechnol 63 (2003), pp. 258–266. A good short review covering the literature through early 2003 on the three primary recombinant bacterial strains being developed (E. coli, Klebsiella oxytoca, and Zymomonas mobilis) for producing ethanol from mixed sugars T.W. Jeffries and Y.S. Jin, Metabolic engineering for improved fermentation of pentoses by yeasts, Appl Microbiol Biotechnol 63 (2004), pp. 495– B. Hahn-Hagerdal and N. Pamment, Microbial pentose metabolism, Appl Biochem Biotechnol (2004), pp. 1207– M. Sedlak and N.W.Y. Ho, Production of ethanol from cellulosic biomass hydrolysates using genetically engineered Saccharomyces yeast capable of cofermenting glucose and xylose, Appl Biochem Biotechnol (2004), pp. 403– M. Sonderegger, M. Jeppsson, B. Hahn-Haegerdal and U. Sauer, Molecular basis for anaerobic growth of Saccharomyces cerevisiae on xylose, investigated by global gene expression and metabolic flux analysis, Appl Environ Microbiol 70 (2004), pp. 2307–

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Conclusions 에탄올 공정의 상업화의 key 는 결국 각 공정간의 운영단가 하락과 자금의 감소 효소 비용의 절감 -> protein engineering 과 process development ; - novel enzyme 개발, protein fusion, 효소 활성 증가 - 다양한 당을 발효할 수 있는 미생물 균주 개발과 전처리 후 가수분해물의 저해물질이나 독성 물질에 대한 내성 균주 개발도 필요.

Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10: Thank you for your attention~!! THE END