Fonctionnement de notre nouvelle Q-PCR

CFX96 de chez BioRad

Caractéristiques de la machine

Bloc chauffant Chauffage par effet Peltier, avec 6 modules thermiques Bloc avec gradient de température : permet d’optimiser la température d’hybridation des amorces (24°C d’écart max sur les 8 lignes) Bloc en nid d’abeille : pour diminuer la masse du bloc et augmenter la vitesse de la rampe de température (5°C/s et précision de 0,2°C)

Système optique Bloc optique avec 6 LED et 6 photodiodes, donc possibilité de faire du multiplex 5 canaux (excitation/émission : 450-730 nm) Vitesse de passage de la navette : 12 sec pour 5 canaux, et 3 sec pour un canal

Autres caractéristiques Appareil autonome Possibilité de faire de la Fast Q-PCR (prog. en 40 min) Gamme dynamique de 10 log Bloc 96 puits, avec possibilité de passage au format 384 Plastique : microplaque 96, barrette de 8, tubes individuels et possibilité de mettre autres consommables que BioRad Volume échantillon : 1 à 50 µL (recommandé de 10 à 25 µL) Module HRM (compris dans notre achat) 5 licences informatiques pour le logiciel Accès aux formules de calcul dans l’aide

Manip de Q-PCR

Ce qu’il faut prévoir avant de lancer une manip de Q-PCR Qualité des ARN et de la Reverse Transcription Design spécifique des amorces Tester les amorces et calculer l’efficacité de PCR pour ce couple d’amorce Quantification absolue ou relative Choix du gène de référence Réplicats biologiques et réplicats techniques

Qualité des ARN Les ARN ne se dégradent pas à la même vitesse et donc si notre ARN se dégrade plus vite que ceux du gène de référence, le rapport est faussé. Vérifier la qualité des ARN sur gel d’agarose, au spectro avec les R260/280 et R260/230 ou mieux électrophorèse capillaire ARNr 25s ARNr 18s ARNr chloroplastique Smear d’ARNm ARNt Si R260/280 < 1,8 contamination par des protéines Si R260/230 < 2 contamination par des glucides

Qualité de la RT Sensibilité différente selon les enzymes Si RT avec activité ribonucléase : dégradation des ARNm au fur et à mesure de l’avancé de la RT Détection des très faibles quantités d’ARNm

Design d’amorces Amplicon de 75 à 200 pb Amorces de 18 à 30 pb Température d’annealing de ≈ 60 à 65°C Tm des amorces proches (moins de 2°C entre les 2) Entre 30 et 70% de GC Un maximum de G/C dans les 5 premières bases et un maximum de A/T dans les 5 dernières bases Limiter la répétition d’un même nucléotide (maxi 3) Limiter les dimers d’amorces (logiciel PerlPrimer par ex.) Limiter les structures secondaires (logiciel mfold par ex.) Vérifier la spécificité des amorces par BLAST

PerlPrimer Analyse des dimérisations possibles entre les amorces

Design d’amorces Amplicon de 75 à 200 pb Amorces de 18 à 30 pb Température d’annealing de ≈ 60 à 65°C Tm des amorces proches (moins de 2°C entre les 2) Entre 30 et 70% de GC Un maximum de G/C dans les 5 premières bases et un maximum de A/T dans les 5 dernières bases Limiter la répétition d’un même nucléotide (maxi 3) Limiter les dimers d’amorces (logiciel PerlPrimer par ex.) Limiter les structures secondaires (logiciel mfold par ex.) Vérifier la spécificité des amorces par BLAST

mfold

Design d’amorces Amplicon de 75 à 200 pb Amorces de 18 à 30 pb Température d’annealing de ≈ 60 à 65°C Tm des amorces proches (moins de 2°C entre les 2) Entre 30 et 70% de GC Un maximum de G/C dans les 5 premières bases et un maximum de A/T dans les 5 dernières bases Limiter la répétition d’un même nucléotide (maxi 3) Limiter les dimers d’amorces (logiciel PerlPrimer par ex.) Limiter les structures secondaires (logiciel mFold par ex.) Vérifier la spécificité des amorces par BLAST

Pour valider un couple d’amorces Calculer l’efficacité d’amplification du couple d’amorce avec une gamme standard La pente de la droite donne l’efficacité de la PCR pour ce couple : N = N0 x En Si proche de 100% : N = N0 x 2n Dilution de l’ADN pour avoir une gamme avec 4 ou 5 points

Pour valider un couple d’amorces Vérifier que le couple d’amorce ne forme qu’un produit d’amplification, avec la melting curve :

Quantification absolue ou quantification relative c’est plus avec ADNg pour déterminer le nombre de copie dans X ng d’ADN. Quantification relative : On compare l’expression, par ex. entre des traitements par rapport au témoin ou bien entre différents tissus.

Choix du gène de référence C’est un gène qui s’exprime tout le temps et dont le niveau d’expression ne varie pas en fonction des conditions expérimentales utilisées. On en utilise souvent plusieurs et on voit celui qui varie le moins en fonction de notre expérience.

Les réplicats Réplicats biologiques : plusieurs témoins, plusieurs individus ayant subit le traitement A,… Cela permet de montrer que la différence d’expression du gène est bien dû au traitement et non à un individu bizarre. Réplicats techniques : on dépose 2 ou 3 fois le même échantillons à chaque fois (duplicat ou triplicat technique)… Cela permet de normaliser le pipetage et de s’assurer encore une fois que la différence est dû au traitement et pas à un mauvais pipetage.

exemple Étude du gène 1 Gamme en 4 points pour calculer l’efficacité 3 traitements A, B, C + 1 témoin (4 conditions expérimentales) Penser aux NTC et aux NRT Donc il faut penser aux gènes de ménage (par ex. l’actine et GAPdH), à la gamme pour chaque gène, aux réplicats biologiques (4 individus pour chaque traitement), aux réplicats techniques (triplicat) et aux témoins négatifs : Pour les gammes : 4 x 3 x 3 = 36 Pour l’expérience : 4 x 4 x 3 x 3 + 3 + 4 x 3 = 159 Total : 195 puits, soit plus de 2 plaques 96

Optimisation Optimiser la plus haute température pour l’annealing des amorces Polymérase Hot Start (que 3 min si couplage avec Ac) Minimiser le temps de dénaturation Hybridation/élongation en une étape Plastique blanc renvoie plus fluorescence donc meilleure sensibilité (jusqu’à 2 Ct d’écart) Nouvelle chimie FAST PCR

Fonctionnement du logiciel CFX96 de BioRad Fonctionnement du logiciel CFX Manager

On commence par remplir le protocole

Si On peut bien sûr modifier ce protocole

Ajouter une melting curve et la modifier si nécessaire

Puis on remplit le plan de plaque

Si

Si Il faut bien remplir le plan de plaque

Il faut sélectionner le fluorophore et le type d’échantillon

Donner le nom du gène, le nom de l’échantillon, le nombre de réplicat

Et on peut lancer le RUN