(2012/2013) LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGICHE DEL FARMACO INSEGNAMENTO DI UNIVERSITA’ DEGLI STUDI NAPOLI FEDERICO II Titolare Dr. Roberto Russo FARMACOLOGIA APPLICATA

I più importanti tipi di psicosi comprendono: La schizofrenia I disordini affettivi (mania, depressione) Le psicosi organiche (turbe mentali secondarie)

Test in vitro

CONCETTI BASILARI PER LO STUDIO DEL BINDING RECETTORIALE Incubando il tessuto contenente i recettori R ed il ligando radiomarcato D in opportune condizioni sperimentali si formerà il complesso RD secondo l’equazione R + D RD I recettori sono presenti in concentrazioni molto piccole nei tessuti. Quando il sistema raggiunge l’equilibrio in ogni provetta avremo:

Equilibrio Ligando radiomarcato D Recettore libero R Recettore RD Il recettore libero R non potrà essere misurata ma possiamo misurare la quantità di complesso ligando-recettore RD. Per poter calcolare la quantità del complesso RD è necessaria un’operazione di separazione del legato (Bound) dalla quantità di ligando radiomarcato D libero in soluzione non legato al tessuto (Free).

Filtrazione Il metodo più semplice e classico è quello della filtrazione su membrane in fibra di vetro Whatman GF/A, GF/B, GF/C dove varia la porosità 0.7 μm-2.7 μm Metodi di separazione del RD dal mezzo di reazione Il tessuto contenente il recettore legato al radioligando aderisce al filtro mentre il radioligando libero passa attraverso la membrana.

Le proteine ostruiscono il filtro Il ligando radiomarcato tende a legarsi alle fibre del filtro. Elevata velocità di filtrazione deve essere completata in 4-5 secondi per evitare che il ligando radiomarcato si stacchi dal recettore. In genere si perde il 5% di RD Limiti e precauzioni della filtrazione

L’esperimento di saturazione viene effettuato determinando il Binding Totale e il Binding Non-Specifico a differenti concentrazioni di ligando radiomarcato. Binding Totale Viene definito aggiungendo al tessuto concentrazioni crescenti di radioligando Binding Non-Specifico Viene definito in presenza di ligando non marcato ad elevata concentrazione alla quale tutto il radioattivo viene spiazzato dai siti specifici di legame Approccio sperimentale all’analisi di saturazione

Vogliamo determinare il binding specifico all’equilibrio per un determinato radioligando alla concentrazione di 0.5 nM Provetta 1 (Binding totale) Tessuto + Rx (0.5 nM) Lettura radioattività =2500 cpm Provetta 2 (Binding non specifico) Tessuto + Rx (0.5 nM) + Ligando non marcato (10 μM) Lettura radioattività= 500 cpm Alla concentrazione 0.5 nM di RX il complesso RD (Binding Specifico, Bound) sarà : = 2000 cpm Esempio:

Il valore 500 cpm rappresenta la quantità di RX che si è legato a siti non specifici di legame. L’impiego del ligando non marcato ad levata concentrazione spiazza RX solo da tutti i siti specifici ma non da quelli non specifici. Realizzando differenti concentrazioni di RX e definendo per ciascuna il Binding Totale e il binding Non-Specifico si calcola il Binding Specifico. Valutazioni dei dati

RISULTATI

Saggio del [ 3 H]-spiroperidolo (D2 receptor binding) L’impiego di antagonisti del R D2 in studi di binding su corpo striato di mammifero è predittivo di un’azione antipsicotica in vivo PROCEDURA Si preleva rapidamente il cervello di ratto ( g), si isola il corpo striato e si pone in ghiaccio Si effettuano una serie di omogeneizzazioni e centrifugazioni a 4°C al fine di ottenere un pellet che è sospeso in un opportuno tampone contenente Na, K, Mg e Ca. I campioni sono incubati a 37°C per 20 minuti con [ 3 H]-spiroperidolo (0.25 nM) e diverse concentrazioni del F da testare; quindi sono lasciati in ghiaccio per 45 minuti. Per valutare il non specific binding al posto del campione viene incubato il butaclamolo (2  M) Si lava il campione (3x). Si aggiunge il liquido di scintillazione e si legge la radioattività con il  counter

Valutazione dei risultati [ 3 H]-spiroperidolo = total binding [ 3 H]-spiroperidolo + butaclamolo = non specific binding Binding specifico = total binding – non specific bineding % inibizione = 100 – binding specifico come % del valore di controllo Binding totale- Binding non specifico= binding specifico

Test in vivo

Autostimolazione celebrale nel ratto In diverse specie animali la stimolazione elettrica di particolari zone celebrali produce una sensazione piacevole che l’animale tende a rinforzare. La stimolazione elettrica avviene per mezzo di microelettrodi impiantati stabilmente nella zona ipotalamica Tali stimoli inducono l’animale ad un comportamento stereotipato (es. abbassare una leva) al fine di rinforzare lo stimolo piacevole I neurolettici sono in grado di bloccare tale autostimolazione.

Procedura Ratti maschi ( g) sono anestetizzati con pentobarbital e posizionati con il capo sul piano dello stereotasso Viene inciso il cranio e con un microtrapano si opera un foro attraverso il quale viene posizionato un microelettrodo Il foro viene chiuso con cemento osseo e la ferita suturata Dopo 10 giorni dall’impianto i ratti vengono allenati a pressare la leva per ottenere la stimolazione elettrica La durata del treno di impulsi può variare da 5 o 30 secondi e l’intensità da 0.1 a 0.5 mA. Il singolo impulso ha la durata di 0.5 msec con una pausa di 2.5 msec Si effettuano una serie (di solito 5) di sessioni al fine di ottenere una risposta riproducibile intesa come numero di volte che il ratto pressa la leva

Procedura Ratti maschi ( g) sono anestetizzati con pentobarbital e posizionati con il capo sul piano dello stereotasso Viene inciso il cranio e con un microtrapano si opera un foro attraverso il quale viene posizionato un microelettrodo Il foro viene chiuso con cemento osseo e la ferita suturata Dopo 10 giorni dall’impianto i ratti vengono allenati a pressare la leva per ottenere la stimolazione elettrica La durata del treno di impulsi può variare da 5 o 30 secondi e l’intensità da 0.1 a 0.5 mA. Il singolo impulso ha la durata di 0.5 msec con una pausa di 2.5 msec Si effettuano una serie (di solito 5) di sessioni al fine di ottenere una risposta riproducibile intesa come numero di volte che il ratto pressa la leva

L’esperimento di controllo (veicolo) consiste in una sessione di 30 minuti Il giorno seguente, il f. da testare è somministrato per via orale 60 minuti prima della sessione di 30 minuti Valutazione dei risultati Il numero di volte che il ratto pressa la leva dopo il trattamento col F è confrontato con quello del controllo che viene considerato essere il 100% Mediante la somm. di diverse dosi di F si ricava la ED 50

Metodi di studio di farmaci ad attività neurolettica - Golden hamster test - ibernazione artificiale - catalessia - comportamento indotto da amfetamina - tossicità da amfetamina - inibizione dello “jumping” - comportamento indotto da apomorfina - climbing da apomorfina - vomito da apomorfina

Golden hamster test L’aggressività del maschio Mesocricetus auratus è inibita da F neurolettici a dosi che non hanno effetti sull’attività motoria

Golden hamster test

Ibernazione artificiale Gli animali sono posti in strutture di vetro ermeticamente chiuse e semi-sommerse in acqua ghiacciata. La tensione dell’O 2 diminuisce (x l’attività respiratoria), ed aumenta la quantità di CO 2. A causa del freddo e dell’ipossia, gli animali sono immobili (è ridotta la frequenza cardiaca e la respirazione) e la loro Temperatura rettale diminuisce di 15°C. Il ratto può sopravvivere a queste condizioni per circa 20-24h. Il F è somm. 15 minuti prima dell’inizio dell’esperimento. L’ibernazione artificiale è indotta in maniera dose-dipendente da neurolettici (fenotiazina simili)

I neurolettici che hanno un’azione inibitoria sul sistema dopaminergico nigrostriatale inducono catalessia. Test utile per valutare sia l’efficacia neurolettica che gli effetti collaterali Catalessia nei ratti è definita come l'incapacità di correggere una condizione esterna, una postura inusuale per un periodo prolungato di tempo. Catalessia

Vengono utilizzati gruppi di 6 ratti maschi Sprague-Dawley o Wistar con un peso corporeo tra 120 e 250 g. Dopo somministrazione ip; sc; os gli animali vengono posti individualmente in gabbie di plastica con un tassello di legno montato orizzontalmente 10 centimetri dal pavimento e 4 cm dall’estremità della gabbia. Gli animali sono ambientati alla gabbia per 2 min. Poi, ogni animale è messo con attenzione sull’asta. E’ determinato la quantità di tempo trascorso con almeno una zampa anteriore sull’asta. Quando l'animale rimuove le zampe, il tempo viene registrato e il ratto viene riposizionata sulla barra. l’esperimento viene eseguito per tre volte per ciascun animale a 30, 60, 120 e 360 ​​ min. Procedimento Un animale è considerato catalettico se rimane sulla barra per meno di 60 secondi Per le curve dose-risposta, il test viene ripetuto con varie dosi e più animali. Controllo positivo con1 mg / kg ip di aloperidolo. VALUTAZIONE

ALTRI MODELLI IN VIVO 1.Test dell’inibizione del comportamento stereotipato da amfetamina 2.Tossicità da amfetamina 3.Inibizione dello “jumping” da amfetamina e L-dopa 4.Inibizione del “climbing” indotto da apomorfina

Test dell’inibizione del comportamento stereotipato da amfetamina nel ratto L’amfetamina è un agente simpaticomimetico indiretto che induce il rilascio di catecolamine dai loro siti di deposito al livello neuronale. Nel ratto tale sostanza induce un tipico comportamento stereotipato che consiste in un continuo annusare, leccare e masticare (in modo compulsivo) I f. neurolettici prevengono tale comportamento indotto dalla somministrazione di amfetamina

Procedura Gruppi di ratti maschi (n=6, g) sono trattati con d-amfetamina 10 mg/kg s.c. e nello stesso tempo con il farmaco da testare (o veicolo o controllo positivo) per i.p. Gli animali vengono posti in gabbie individuali ed osservati per i successivi 60 minuti Valutazione dei risultati Un animale è considerato “protetto”, se la stereotipia è ridotta o abolita L’efficacia del f. è valutata come la % di animali protetti dal comportamento stereotipato per ogni gruppo considerato La EC 50 è ottenuta testando diverse dosi di f. con n = 10

Tossicità da amfetamina

Inibizione dello “jumping” Una sovrastimolazione dopaminergica induce i topi a saltare. I topi (22-25 g), pre-trattati con amfetamina (4 mg/kg), ricevono 15 minuti dopo L-dopa (400 mg/kg): 175 salti nei successivi 60 minuti Questo fenomeno è bloccato da agenti neurolettici. I F da testare sono somm. 60 min prima della L-dopa. Valutazione: conta dei salti

Inibizione del climbing indotto da apomorfina La somm. di apomorfina nei topi induce un caratteristico comportamento “rampicante”. I F neurolettici inibiscono questo comportamento. Procedimento: Il F (veicolo) è somm. i.p. / x os. 30 min dopo è iniettata s.c. l’apomorfina (3 mg/kg; topi da 20-22g) 10, 20 e 30 min dopo la somm dell’apomorfina, viene valutato il comportamento degli animali

FINE