SDS-PAGE Western blotting (Transfer)

Western Blot의 정의 및 목적 Southern blot : DNA detection Northern blot : RNA detection Western blot : protein detection Protein size별 분리 (SDS) 항원-항체 반응 Detection (HRP-Lumonol, ECL)

Western Blot 실험방법 및 원리 Protein extraction : cell에서 protein을 추출해내는 과정 Protein assay : 분리해 낸 protein의 농도 측정 SDS-PAGE : SDS로 (-) charge를 띄게 한 후 (+) charge를 연결해 protein 분자량별로 분리해내는 과정 Transfer : membrane으로 분리된 protein을 이동 Blocking : skim milk로 block 해주는 과정 항원-항체 반응 : 원하는 단백질에 결합하는 Ab(1st)와 결합하고, HRP가 부착된

SDS-PAGE buffer Sample buffer (5X) 60 mM Tris 25% glycerol 2% SDS 14.4 mM 2-mercaptoethanol 0.1% bromophenol blue 2-mercaptoethanol or dithiothreitol(DTT) : protein의 disulfide bond를 풀어서 protein을 denature시킴. ->protein이 4차 구조로 얽히는 것을 방해, 4차 구조를 파괴시킴.

SDS-PAGE buffer SDS-PAGE tank buffer 25 mM Tris base 250 mM glycine pH 8.3

Western blotting buffer Transfer buffer 48 mM Tris base 39 mM glycine 20% methanol 0.0375% SDS

Materials and Methods Sample buffer SDS-PAGE tank buffer Transfer buffer SDS-PAGE set SDS-PAGE chamber Tank Power supply

Materials and Methods Transfer set Nitrocellulose membrane (NC membrane) Filter paper (3M paper) Sponge Transfer grid Transfer chamber Tank Power supply Ice

Materials and Methods Stain solution Protein stain solution 종류 0.1% Ponceau S NC membrane staining Protein stain solution 종류 Amido black B Ponceau S Coomassie Blue

Materials and Methods SDS-PAGE SDS-PAGE gel을 SDS-PAGE chamber에 고정 Buffer가 빠지지 않도록 고정 Tank에 chamber를 넣은 뒤 SDS-PAGE tank buffer 분주 Inner chamber에 먼저 buffer를 분주 Outer chamber의 눈금 까지 buffer를 분주 Inner chamber에서 buffer의 누수여부를 확인 Sample loading Sample 15ul 분주 Protein marker 3ul 분주

Materials and Methods Sample loading 순서 (조별마다 다르게 loading) Empty Protein marker SDS-PAGE gel

Materials and Methods SDS-PAGE running Stacking gel : 80V (30min) Running gel : 120V (1hr) Stacking gel and running gel : 100V 90min Running 하는 동안 Protein sample이 plate 밖으로 빠지지 않도록 주의하여 시간을 설정

Materials and Methods Transfer 준비 SDS-PAGE gel Transfer grid의 검은색 면이 아래로 하게 한 뒤 sponge와 filter paper를 transfer buffer에 넣음 NC membrane, forceps, gel 절단용 칼을 준비 SDS-PAGE gel 적당한 크기로 자른 후 (절반) filter paper 위에 gel을 올려놓음 기포가 들어가지 않게 NC membrane을 덮어줌 Filter paper, sponge를 덮은 후 grid에 고정

Materials and Methods Transfer grid Transfer running 검은색 면이 일치하도록 하여 Transfer grid를 transfer chamber에 고정을 함 Grid가 고정된 chamber를 tank에 넣고 transfer buffer 분주 Transfer running Tank를 ice가 담긴 box에 넣은 뒤 주변을 tap water로 채워 줌 0.35 A, 90min running → 0.40 A, 50min running

Materials and Methods Ponceau S staining Transfer가 끝나면 chamber에서 grid를 꺼내 흰색 면이 아래로 향하게 하여 위치 상층의 sponge와 filter paper를 제거한 뒤 gel의 모양과 같게 NC membrane을 잘라냄 자른 NC membrane을 Ponceau S stain solution으로 염색 destaining

Western blotting

Results NC membrane 에서의 staining 양상 Protein size marker를 통한 protein size의 판별 유무