Introduction of Bio-lab Technique And Its Application to DNA Computing School of Chemical Engineering Cell & Microbial Engineering Lab. Lee Eun Jeong

DNA Computing Protocol Appropriate Reaction (Hybridization, Enzyme reaction etc.) Amplification Separation Detection

Characteristic of DNA Hybridization Hairpin formation  Triple hybridization  Plasmid

Introduction of un-common PCR

Exclusive PCR (ePCR ) Whiplash PCR Real Time PCR Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)

Exclusive PCR (ePCR ) (1) Template 가 되는 strand 가 안정한 hairpin 구조를 형성 할 경우, DNA polmerase 가 steric hindrance 를 받아 증 폭을 계속 할 수 없음 DNA strand 중 hairpin 구조를 형성하지 않은 strand 들만 증폭하게 되고, hairpin 을 형성한 strand 는 상대 적으로 극소수로 남게 됨 K. Sakamoto et al. : CNF-SAT problem 을 푸는데, ssDNA molecule 의 hairpin 형성과 ePCR 방법을 이용

ePCR (2) DNA polymerase DNA Primer 5 `3 `

Whiplash PCR 부족한 oligomer 에 상보적인 sequence 가 연속으로 오면 증폭이 멈춤 ‘goto’ 문에 이용, State transition (Sakamoto et al.)

Real Time PCR (1) 형광 label 된 oligonucleotide probe 를 사용 원하는 product 에 대한 signal 만을 받아들 여 정확하게 정량 PCR 의 product 를 실시간으로 확인 : computing mechanism 이 효율적으로 잘 이루어 지고 있는지의 확인에 이용

Real Time PCR (2) Taq polymerase : 5' exonuclease activity : PCR extension 단계에 target 과 결합되어 있던 형광 lable 된 hybridization probe 를 절단 5'end : reporter dye labeling (ex.fluorescein) 3'end : quencher dye labeling (ex.TAMRA)

Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR) High sensitivity 소량의 mRNA 로부터 cDNA 를 얻어 분석

Application of Triple Hybridization

Triple Hybridization (1)

Triple Hybridization (2)

Triple Hybridization (3) Probe 로 이용 → Double strand 에 third strand 가 hybridization (TAC) → Third strand 를 probe 로 이용, dsDNA 의 separation → Affinity Chromatography, Bead separation 에 이용

Magnetic bar

Triple Hybridization (4) Advantage → ssDNA 의 unstability 극복 → dsDNA 상태로 검출되므로 Integrity 의 손상을 입지 않고 separation 이 가능 ( 기존의 방법은 denaturing step 을 거침 )

Triple Hybridization (5) Example → SAT problem 의 각 clause 에 대한 True value 와 결합 → MIS problem 에서 edge 로 연결된 vertex 를 포함하는 subset 의 제거

MIS problem - maximum independent set problem - G=(V,E) 로 주어진 graph 에서 edge 로 연결된 vertex 를 모두 포함하지 않는 subset S 를 찾 는 문제

Triplet Formation 을 이용한 MIS Problem Solving Strategy Library string synthesis Stable dsDNA library formation Split into two tube

Transfer the supernatant to one tube Repeat for the all edge Separation, Amplify & Sequencing Passing through The affinity column immobilized the third strand of each edge’s variables

SAT problem

Triplet Formation 을 이용한 SAT Problem Solving Strategy Library string synthesis Passing through The affinity column immobilized the third strand of each clause’s variables Eliminate the supernatant

Repeat to all clause Make the column triplex-destabilizing condition Separation of the solution Amplify and Sequencing

Plasmid

Plasmid 세균의 세포 내에 염색체와 별개로 존재 독자적으로 증식 가능 고리모양의 유전자 세균이 증식할 때 함께 증폭됨 유전공학 기술에서 널리 응용되는 vector 재조합유전자 DNA 합성에 유용한 도구

Plasmid Map Example

Advantage of Plasmid Computation 에 필요한 DNA plasmid 를 구입하여 실험 목적에 적합하도록 변형시켜 사용 Plasmid 의 환경 ( 효소, buffer, 온도, 염의 농도 등 ) 변화 → plasmid 행동의 다양한 변화로, single plasmid 로 computer 와 유사 하게 구현 Computation 과정 내내 double strand 로 유지됨 → ssDNA 의 self-annealing 이 일어나지 않음 PCR amplification 불필요 Bacteria (E. coli) 에 transformation → stock 을 만들어두면 저장이 편리하고 쉽게 다시 이용 가능

Plasmid 를 이용한 Computing 예 (1) MIS problem (T. Head et al) - maximum independent set problem - vertex 를 나타내는 ‘ station ’ sequence 를 모두 포함 하는 DNA segment 를 plasmid 에 포함시킴 - 각 station 의 양끝에 specific 한 RE site 첨가 - edge 로 연결되는 vertex 중 하나를 제거할 때 RE 이용

MIS 에 이용된 plasmid

Computing 에 이용될 수 있는 Plasmid Technique Ampicillin resistance 이용 -Amp r sequence 사이에 fragment 삽입 Gene coding sequence 이용 - Protein assay (secretion 문제 ) E. coli 의 lac Z gene 이용 - lac Z gene 사이에 fragment 삽입 Replica Plate – 동일한 sequence 지닌 plasmid 복제

Reference Molecular Computation by DNA Hairpin Formation, Kensaku Sakamoto et al. science vol. 288, 19 May 2000 State Transitions by Molecules, Kensaku Sakamoto et al. Biosystems 52 (1999) Computing with DNA by operating on plasmids, Head et al., Biosystems 57 (2000) Solution of a 20-Variable 3-SAT Problem on a DNA Computer, Ravinderjit S. Bralch et al. science vol. 296, 19 April 2002 Recombinant DNA, James D. Watson, Michael Gilman, Scientific American Books, 2 nd ed Triple-Helical Nucleic Acids, Valery N. Soyfer, Vladimir N. Potaman, Springer-Verlag New York, Inc Brock Biology of Microorganisms, Madigan, Martinko, Parker, Prentice Hall, 9 th ed., 2000