Plasmid mini prep DNA electrophoresis Transformation(Expression) 6주차 생화학 및 분자생물학실험 Plasmid mini prep DNA electrophoresis Transformation(Expression)

Content Purpose Introduction & Theory Plasmid mini prep Agarose gel electrophoresis DNA quantitation Transformation(Expression) Materials & Methods Results

Purpose _ Plasmid mini prep. Plasmid mini prep kit를 이용해서 E.coli 로부터 DNA를 분리하여 정량 해보고 Agarose gel electrophoresis를 통해 확인한다. 얻어진 DNA와 Protein Expression용 Competent cell을 이용하여 Transformation한다.

Introduction & theory 1 2 3 Plasmid mini prep Solution 1 Solution 2 50 mM Glucose 25 mM Tris-Cl (pH 8.0) 10 mM EDTA (pH 8.0) RNase Solution 3 2 0.2 N NaOH 1% SDS 3 5 M Potassium acetate glacial acetic acid Distilled water

Introduction & theory Plasmid mini prep Solution Components 역할 Solution I Glucose 삼투압 조절 EDTA Metal ion chelating Tris-Cl pH 조절 RNase A RNA 분해 Solution II NaOH DNA Denaturation SDS Cell wall lysis Solution III Potassium acetate pH의 중성화 및 Plasmid DNA renaturation Glacial acetic acid Distilled water

Introduction & theory Plasmid mini prep

Introduction & theory Plasmid mini prep

Introduction & theory DNA quantitation Spectrophotometry 원자 또는 분자가 외부에서 빛 에너지를 흡수 → 분자운동 (전자 전이 및 진동, 회전, 병진) 바닥 상태에 있는 원자나 분자는 그 종류에 따라 특정 파장의 자외선 및 가시광선을 흡수하며 전자전이를 일으키면서 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 흡수하는 파장 → 원자 또는 분자의 전자구조, 조성 흡수하는 빛의 세기 (흡광도) → 원자나 분자의 농도 결정

Introduction & theory Spectrophotometry Absorbance A= εbc ε: molar absorption coefficient (L·mol-1· cm-1 ) b: path length (cm) c: molar concentration of the sample) (mol/L) double-stranded DNA 0.020 (μg/ml)-1 cm-1 single-stranded DNA and RNA 0.027 (μg/ml)-1 cm-1 T (Transmittance) = I1/I0 %T = 100 x T A (Absorbance) = log10 I0/I1 = log10 1/T = log10 100/%T = 2-log10 %T

Introduction & theory Spectrophotometry Absorbance - A260: DNA - A280: Protein - A260/280: Purity (DNA and RNA: 1.8 and 2.0) - A260= 1.0 → 50 μg/ml double-stranded DNA → 40 μg/ml single-stranded DNA → 20 μg/ml single-stranded oligonucleotide * Cuvette - glass : visible ( >370nm) - quartz cell : UV & visible - plastic cell : visible

Introduction & theory Intensity of fluorescence emitted by ethidium bromide : Comparison with fluorescence intensity of the quantified DNA size marker. As little as 1-5 ng of DNA can be detected by this method.

Introduction & theory Intensity of fluorescence emitted by ethidium bromide Agarose gel Electrophoresis

Introduction & theory Intensity of fluorescence emitted by ethidium bromide Agarose gel Electrophoresis

Introduction & theory Intensity of fluorescence emitted by ethidium bromide Agarose gel Electrophoresis

Materials & Method Plasmid mini prep. Agarose gel electrophoresis

Plasmid mini prep. Cell pre-inoculation 지난 시간에 Transformation을 통해 얻은 colony 1개를 Amp이 들어간 5 ml LB media에 접종한다. 접종 후 37ºC incubator에서 16~18시간 incubation한다. Incubation이 끝난 후 Plasmid mini prep kit를 사용하여 Plasmid DNA를 추출한다.

Plasmid mini prep. LaboPass Plasmid mini prep Kit Cell culture 5ml을 Centrifuge하여 Cell Down시킨다. 그 후 Pellet만 남기고 Supernatant는 제거한다. Pellet에 Buffer S1 250μl를 섞어 Pellet을 풀어준다. (Vortexing) Buffer S2 250μl를 섞어준다. (Inverting 4~5회) Buffer S3 350μl를 섞어준다. (Inverting 4~5회) 10분 동안 Centrifuge한다. Centrifuge 후, Supernatant을 Spin column으로 옮긴다. 그리고 30초간 Centrifuge를 해준다. Wash Buffer 700μl를 섞고 30초간 Centrifuge를 해준다. 추가로 Centrifuge를 1분간 더 해준다. (건조) Spin column에 dH2O 50μl를 첨가한다. 그리고 1분간 Centrifuge를 해준다.

Agarose gel electrophoresis & Quantitation Agarose gel Electrophoresis Plasmid mini prep 후 얻어진 Plasmid DNA를 전기영동으로 확인해본다. DNA quantitation Spectrophotometer를 OD260으로 setting. 3’DW 200μl 로 blank를 잡는다. 3’DW 198μl + DNA 2μl를 넣어 만든 sample의 흡광도를 측정하여 DNA의 농도를 확인한다.

Results Agarose gel 사진을 통해 Plasmid mini prep 이 잘 되었는지를 확인 Colony의 확인을 통해 Transformation이 잘 되었는지를 확인