SEPARAZIONE DI MISCELE DI PROTEINE NEI LORO COMPONENTI Un metodo molto utilizzato è la elettroforesi sul gel bidimensionale dove in un primo tempo si eluisce la miscela di proteine in presenza di un gradiente di pH. Poi si esegue una seconda corsa su un gel di poliacrilammide che separa in funzione del peso molecolare. Lo schema dell’esperimento è il seguente:

La cromatografia di Isoelectric Focusing (IEF) si ottiene creando un gradiente di pH immobilizzato (IPG) su gel. L’IPG sono matrici di gel di acrilammide co- polimerizzato con segmenti di acido debole (Immobiline) via via a valori di pK diversi. Il gradiente di pH risulta completamente stabile tranne che per valori di pH molto alcalini (>12).

Lo studio dell’identificazione di una proteina procede nel secondo il seguente schema generale: a. La proteina viene analizzata per conoscere la massa molecolare b. Viene poi digerita con un enzima opportuno. Spesso viene utilizzata la tripsina perchè ciascun frammento proteolitico contiene un residuo basico arginina (R) o lisina (K) e quindi soggetto a ionizzazione positiva. La miscela del digerito viene analizzata, senza una separazione preliminare, con la spettrometria di massa per conoscere la massa di tutti i frammenti. Lo spettro viene chiamato mappa peptidica e, se la proteina esiste già nelle banche dati, questo è spesso sufficiente per riconoscere la proteina.

peptidi MPSER …… GTDIMR PAKID …… HPLC alla MS/MS MPSERGTDIMRPAKID..... proteina Una volta separate mediante elettroforesi bidimensionale, le singole proteine sono analizzate mediante spettrometria di massa (MS), dopo aver eseguito una parziale frammentazione mediante proteasi (es. tripsina). La quantità di informazione estraibile varia da peptide a peptide. Alcuni peptidi possono generare informazione sufficiente per determinare l’intera sequenza, altri solo sequenze di 4 o 5 amminoacidi. Peptidi a circa 2500 Da o meno producono i dati più utili. alla MS

Circa 4 µL di soluzione bastano per l’analisi della miscela triptica che corrisponde ad una concentrazione di proteina originale pari a 1-10 pmol/µ L. Quindi il sequenziamento mediante MS/MS è una tecnica sensibile che consuma poco campione. La quantità di informazione estraibile varia da peptide a peptide. Alcuni peptidi possono generare informazione sufficiente per determinare l’intera sequenza, altri solo sequenze di 4 o 5 amminoacidi. Alcuni procedimenti di analisi possono essere automatizzati da software specifici, ma in generale l’analisi di tutta l’informazione contenuta è un processo che richiede tempo ed accuratezza se si vogliono ottenere dati credibili.

Spettrometria di Massa Tandem

La spettrometria di massa tandem (MS-MS): Come ottenere informazioni strutturali e sulla sequenza attraverso la spettrometria di massa. La spettrometria di massa Tandem (MS-MS) è utilizzata per ottenere informazioni strutturali circa un composto attraverso la frammentazione di ioni specifici prodotta all’interno dello spettrometro ed identificando i frammenti ottenuti. Da queste informazioni si possono ottenere dati strutturali sulla molecola nativa. La spettrometria di massa Tandem può anche essere utilizzata per riconoscere un composto specifico in una miscela complessa attraverso il suo schema di frammentazione.

Spettrometro che opera in modo MS (sopra) o MS – MS (sotto).

Sequenziamento di peptidi con spettrometria di massa Tandem. (P. Roepstorrf, J. Fohlmann, Biomed. Mass Spectrom., 1984, 11, 601; R. S. Johnson, K. Biemann, Biomed. Environ. Mass Spectrom., 1989, 18, 945; Four-Sector Tandem Mass Spectrometry of Peptides, A. E. Ashcroft, P. J. Derrick in "Mass Spectrometry of Peptides" ed. D. M. Desiderio, CRC Press, Florida, 1990). Il metodo MS-MS più utilizzato in biochimica è quello dell’analisi dei prodotti che è impiegato con successo nel sequenziamento di peptidi e nucleotidi. Sequenziamento di peptidi: H 2 N-CH(R')-CO-NH-CH(R")-CO 2 H I peptidi frammentano in un modo ben conosciuto. Le molecole protonate frammentano in catena principale e a volte anche sulle catene laterali.

Ci sono tre diversi tipi di legami che possono essere rotti in catena principale: l’NH-CH, il CH-CO e il CO-NH. Ciascuna rottura dà luogo a due specie, una neutra ed una carica; solo le specie cariche vengono rivelate dallo spettrometro. La carica può risiedere su l’uno o l’altro dei due frammenti in dipendenza della chimica e dell’affinità delle due specie per il protone. Quindi per ogni residuo di amminoacido possono essere ottenuti sei tipi di frammenti. Nella figura seguente sono marcati con a, b e c gli ioni che hanno la carica sul frammento ammino-terminale e x, y e z gli ioni che hanno la carica sul frammento C-terminale. La rottura più comune è quella sul legame CO-NH che dà luogo a ioni b e/o y. La differenza di massa tra due ioni b (o y) adiacenti indica la presenza di un certo residuo.

Rottura di legami nel sequenziamento mediante massa Tandem Ione immonio

Tabella delle masase dei residui di amminoacidi SimboloStrutturaMassa (Da) Ala A-NH.CH.(CH 3 ).CO Arg R-NH.CH.[(CH 2 ) 3.NH.C(NH).NH 2 ].CO Asn N-NH.CH.(CH 2 CONH 2 ).CO Asp D-NH.CH.(CH 2 COOH).CO Cys C-NH.CH.(CH 2 SH).CO Gln Q-NH.CH.(CH 2 CH 2 CONH 2 ).CO Glu E-NH.CH.(CH 2 CH 2 COOH).CO Gly G-NH.CH 2.CO His H-NH.CH.(CH 2 C 3 H 3 N 2 ).CO Ile I-NH.CH.[CH.(CH 3 )CH 2.CH 3 ].CO Leu L-NH.CH.[CH 2 CH(CH 3 ) 2 ].CO Lys K-NH.CH.[(CH 2 ) 4 NH 2 ].CO Met M-NH.CH.[(CH 2 ) 2.SCH 3 ].CO Phe F-NH.CH.(CH 2 Ph).CO Pro P-NH.(CH 2 ) 3.CH.CO Ser S-NH.CH.(CH 2 OH).CO Thr T-NH.CH.[CH(OH)CH 3 ).CO Trp W-NH.CH.[CH 2.C 8 H 6 N].CO Tyr Y-NH.CH.[(CH 2 ).C 6 H 4.OH].CO Val V-NH.CH.[CH(CH 3 ) 2 ].CO- 99.1

Il grado di frammentazione sulle catene laterali dipende dal tipo di analizzatori utilizzati. Uno strumento a settore magnetico – settore magnetico darà collisioni ad alta energia che favoriscono la frammentazione delle catene laterali. Gli strumenti a quadrupolo–quadrupolo e quadrupolo–tempo di volo sono caratterizzati da frammentazioni a bassa energia e quindi danno poche frammentazioni sulle catene laterali.

Gli ioni immonio compaiono nella zona a bassi m/z dello spettro MS – MS. Ciascun residuo di amminoacido porta ad uno ione immonio diagnostico ad eccezione delle coppie lisina (K) - glutammina (Q) e leucina (L) – isoleucina (I) che producono ioni immonio con la stessa m/z ( 86 per I e L e 101 per K e Q). Gli ioni immonio sono utili per confermare la presenza di molti degli amminoacidi in un peptide sebbene non diano informazioni sulla posizione di quei residui nella sequenza.

Qui di seguito viene illustrata l’analisi MS – MS di ioni prodotti da un peptide. La massa molecolare del peptide è misurata mediante spettrometria standard trovando il valore Da. Nello spettro il valore dominante è a m/z che corrisponde allo ione protonato (M+H + ). Gli ioni che danno origine a questo frammento sono stati separati dal primo analizzatore, fatti passare per la camera di frammentazione ed analizzati dal secondo analizzatore per produrre lo spettro MS – MS. Nell’esempio il peptide frammenta soprattutto sul legame CO – NH e dà luogo a ioni di tipo b ed y.

Sequenziamento di un peptide mediante spettrometria di massa tandem.

La serie “b” degli ioni è stata marcata con linee blu mentre quella “y” con linee rosse. Può essere calcolata la differenza di massa tra membri adiacenti della serie; p. es. b3-b2 = = Da che è equivalente ad una glutammina (E) e similmente y4 - y3 = = Da che è equivalente ad una fenilalanina (F). In questo modo utilizzando la serie “b” o la serie “y” può essere ottenuta la sequenza che corrisponde a NFESGK (facendo attenzione che la serie “y” va letta da destra a sinistra) Lo ione immonio a m/z 102 conferma solo la presenza della glutammina (E) nel peptide.

A volte può essere ottenuta l’intera sequenza della proteina; alcune proteine generano dati sufficienti per coprire il % dell’intera sequenza che è ragionevolmente sufficiente ad identificare la proteina. Spesso una sequenza “marcatore” di 4 – 5 amminoacidi ottenuta da un singolo peptide di origine proteolitica è sufficiente ad identificare una proteina attraverso una banca dati.

Generalmente lo spettro MS dà informazioni sulle masse molecolari dei componenti del digerito proteico che vengono poi utilizzate per cercare in una banca dati sulla base di alcuni dei picchi di massa ottenuti. Se la ricerca nella banca dati non è fruttifera sia perchè la proteina non è stata catalogata sia perchè non è già stata caratterizzata o perchè i dati non sono così accurati per discriminare tra diverse soluzioni proposte dalla banca dati, allora servono nuovi dati. Questo può essere ottenuto purificando il campione ed utilizzando tecniche MS – MS di singoli peptidi provenienti dal digerito per tornare poi alla ricerca nella banca dati.