How to produce biodiesel more effectively: computational biology approach 1 Prof. Dr. José Gilberto Jardine Biologia Computacional: Desenho de Fármacos e Agroquímicos

1. A energia no mundo 2. A energia no Brasil 3. Biocombustíveis 3.1 Definição 3.2 As quatro gerações 3.3 Produção no mundo 3.4 Situação no Brasil 4. Biodiesel 4.1 Matérias primas Gorduras Álcool 4.2 Processos de obtenção: catálise inorgânica catálise enzimática 4.3 Enzimas lipolíticas 4.4 Biologia computacional molecular e as lipases 5. Exercício: modificação do caráter hidrofílico de lipase 6. A patente do GPBC Conteúdo programático

Esgotamento de reservas de petróleo e redirecionamento de utilização deste + Grandes volumes de resíduos gerados pela indústria agrícola e de alimentos (biomassa) Fontes renováveis de energia BIOCOMBUSTÍVEIS BIOENERGIA

BIOENERGIA  BIOETANOL  BIODIESEL  BIOGÁS  FLORESTAS ENERGÉTICAS  RESÍDUOS AGRO FLORESTAIS Etanol Cana/Etanol Grãos/EtanolTubérculos/ Etanol Celulósico/Metanol de Biomassa/ Cogeração Energia (térmica e elétrica). Oleíferas (Oleaginosas, Palmáceas,....) Região Norte/Região Nordeste/Região Centro Sul Biodigestores/Biogás Suínos e Aves/Vinhaça Geração de Energia Elétrica Biomassa Vegetal/Carvão Vegetal/Geração de Energia Elétrica Setor Sucroalcooleiro/Setor Arroz/Resíduos de Madeira/Resíduos e Lixos 4

5 Fontes de Energia Mundo

Matriz Energética Brasileira Quatro fontes serão responsáveis por 77% do consumo Três fontes correspondiam a 74% do consumo Três fontes correspondiam a 74% do consumo 6

Biocombustíveis no Mundo em 2012 (etanol + biodiesel)

BIOCOMBUSTÍVEL Definido como qualquer combustível derivado de biomassa BIOMASSA Definida como a fração biodegradável de produtos e resíduos de material orgânico de origem biológica que se encontra disponível de uma forma sustentavelmente renovável ou recorrente, e que pode ser usada como fonte líquida de energia mediante processos de conversão.

Bioetanol e Biodiesel Os biocombustíveis foram usados nos primórdios da indústria automobilística: Rudolf Diesel sugeriu o uso do óleo de amendoim em seu motor e Henry Ford foi um dos maiores defensores do etanol, fabricando modelos específicos para esse biocombustível. Veículo Ford adaptado pelo INT em 1925 para demonstrações do uso de bioetanol puro como combustível.

“Atualmente, os combustíveis fósseis são responsáveis pela maior parte da malha energética do setor de transportes. Entretanto, os combustíveis renováveis serão cada vez mais empregados, caminhando-se assim para uma substituição progressiva”. Rudolf Diesel, 1912

As quatro gerações dos Biocombustíveis Biocombustíveis de primeira geração: produzidos pela conversão tecnológica convencional de açúcares, amido ou óleo vegetal. BIOCOMBUSTÍVEIS LÍQUIDOS DERIVADOS DE BIOMASSA

2 ª Ge ração: uso de todas as formas de biomassa lignocelulósica como matéria prima convertidas via dois principais caminhos - rota bioquímica ou rota termoquímica. Microrganismos modificados geneticamente podem transformar biomassa em combustíveis gasosos como biogás e biohidrogênio, por meio de um processo anaeróbio. Inovações em biologia sintética podem produzir organismos biológicos artificiais que realizam estas modificações de maneira altamente eficiente.

3 ª Geração: baseada em avanços feitos na fonte - a produção de biomassa. Avanços recentes em biologia de plantas, o aparecimento de técnicas de multiplicação rápida e extremamente eficiente, os rápidos avanços no campo da genômica, promete resultar em plantas com propriedades que as tornam mais apropriadas para a conversão em bioprodutos: Eucalipto com baixo conteúdo de lignina Plantações com teor de açúcar mais alto (sorgo doce).

4ª Geração: árvores modificadas que armazenam mais gás carbônico que suas congêneres comuns. O feito foi alcançado com eucalipto. Em sistemas de produção de quarta geração, as fontes de biomassa são vistas como eficientes máquinas captadoras de carbono que retiram CO 2 da atmosfera e o armazenam em seus galhos, troncos e folhas. A biomassa rica em carbono é então convertida em combustível e gases por meio de técnicas de segunda geração.

BIODIESEL DE ÓLEOS VEGETAIS

O Biodiesel no Brasil não é uma novidade Breve histórico  1920:  1920: Primeiras referências sobre produção e uso de óleos vegetais como combustíveis.  1950:  1950: Estudos sobre o uso de diversos óleos vegetais filtrados em caminhões com motor diesel 6 cilindros (Instituto de Óleos do Ministério da Agricultura)  1979/80 (Governos Geisel/Figueiredo):  1979/80 (Governos Geisel/Figueiredo): ProÓleo  2003:  2003: Retomada do ProÓleo chamado agora Programa Nacional de Biodiesel

 2005 – Lançamento do PNPB;  2008 – B2 obrigatório (mistura de 2% do biodiesel);  2010 – B5 obrigatório  2014 – Expectativa de lançamento da Fase 2 do PNPB (B10 em 2020 ?)  2005 – Lançamento do PNPB;  2008 – B2 obrigatório (mistura de 2% do biodiesel);  2010 – B5 obrigatório  2014 – Expectativa de lançamento da Fase 2 do PNPB (B10 em 2020 ?) História recente do biodiesel no Brasil 20

Selo Combustível Social Concedido a produtores de biodiesel que: comprem matéria-prima da agricultura familiar em percentual mínimo definido por região Façam contratos negociados com os agricultores familiares Assegurem assistência e capacitação técnica aos agricultores familiares Benefícios do selo Combustível social: Isenção de tributos federais proporcional à compra Melhores linhas de financiamento Maior competitividade comercial Possível acesso preferencial a mercados 21

 Os óleos vegetais possuem elevado poder calorífico e não possuem enxofre em sua composição. Os óleos vegetais seriam os substitutos ideais do óleo diesel de petróleo?  Viscosidade elevada.  Combustão incompleta;  Formação de depósitos de carbono nos sistemas de injeção;  Diminuição da eficiência de lubrificação;  Obstrução dos filtros de óleo e sistemas de injeção;  Comprometimento da durabilidade do motor.  Formação de acroleína pela decomposição térmica do glicerol. Óleos Vegetais como Combustível Os óleos vegetais apresentam algumas desvantagens:

Distribuição espacial das usinas de Biodiesel

Demanda de Biodiesel Projeções para até 2020

Matérias-primas usadas para produzir biodiesel Óleo de Soja Gordura bovina Óleo de Algodão Outras matérias primas 26

Sudeste Sul Centro-Oeste Norte Nordeste Palma Soja Mamona Matérias-primas Algodão Girassol Babaçu Amendoim Canola Gordura Animal Residuais Nabo Forrajero

Matérias-Primas 28

Matérias-primas Biodiesel de Mamona: Solução ou Problema? Agricultura familiar:  Requer muita mão-de-obra para o plantio, cultivo e colheita;  Apresenta uma ótima adaptabilidade em certas áreas do semi-árido nordestino;  Alta produtividade em óleo.   Características fisico-químicas (principalmente a viscosidade) do biodiesel produzido a partir da mamona são bastante diferentes daquelas observadas para os ésteres monoalquílicos derivados de qualquer outro óleo vegetal, o que pode acarretar sérias restrições técnicas. Diferentes viscosidades Oleato (Ac. Oleico) de metila 4,51 mm 2 /s Ricinoleato de metila 15,44 mm 2 /s É preferível que o óleo de mamona seja utilizado na Industria Química. 29

Jatropha curcas (PINHÃO MANSO) Matérias-primas 30

PALMA  Custo de Produção de US$ 240/ton de óleo  Investimento agrícola de US$ 3.500/ha  Mínimo de litros/ha  Cultura Perene  Palma desenvolvida na Costa Rica com produtividade mínima de litros/ha Matérias-primas 31

Vantagens  Origem renovável;  Produção nacional;  Não tóxico. Desvantagens  Deve ser álcool desidratado;  Processo de separação da glicerina mais complexo, implica em maior investimento para purificação do biodiesel. Etanol Vantagens  Menor custo;  Separação imediata da glicerina;  Pode ser produzido a partir de gás de síntese. Desvantagens  Tóxico;  O país é importador do produto. Metanol Matéria-prima

Cadeia de Produção de Biodiesel AGRICULTURA BASES DE DISTRIBUIÇÃO INDÚSTRIA DO ÁLCOOL POSTOS DE SERVIÇOS USO FINAL EXTRATIVISMO RESIDUAIS COLETA EXTRAÇÃO DO ÓLEO Óleo PRODUÇÃO DE BIODIESEL INDÚSTRIA QUÍMICA Álcool Catalisador (KOH) Óleo vegetal Óleo Residual INDÚSTRIA QUÍMICA E FARMACEUTICA Biodiesel Glicerina Biodiesel Subprodutos sólidos 33

Fluxograma do processo de produção de biodiesel por transesterificação (catálise homogenia) 34

Transesterificação Combustível para motores de ciclo diesel (Biodiesel) A transesterificação de óleos vegetais tem mostrado importância estratégica para o setor energético, uma vez que os ésteres produzidos a partir de óleos vegetais e álcoois de cadeia curta (biodiesel) estão se tornando um substituto renovável do óleo diesel mineral. ou

Transesterificação – parâmetros de processo 36

Plantas comerciais A transesterificação alcalina é um processo simples e de domínio público. O problema, no entanto, é o custo e a eficiência da separação das fases e a purificação dos produtos e co-produtos principalmente para o etanol. É importante concentrar esforços no desenvolvimento e melhoria dos processos e de equipamentos utilizados na separação de fases e purificação.

Catalisadores  Catálise homogênea O catalisador e o substrato estão na mesma fase. Exemplos Ácidos: HCl, H 2 SO 4, ácidos sulfônicos Bases: Hidróxidos, carbonatos e alcóxidos de Na ou K.  Catálise heterogênea O catalisador e o substrato não estão na mesma fase, o que permite a fácil separação do catalisador após a reação. Exemplos Ácidos: Zircônia-alumina dopada com tungstênio. Bases: CaO, Ba(OH) 2, Mg(OH) 2, CaCO 3 38

Catalisadores Homogêneos Catalisadores alcalinos são facilmente manipuláveis; Menos corrosivos que os catalisadores ácidos homogêneos.   Número maior de etapas na produção do biodiesel;   Maior produção de resíduos provenientes da neutralização do catalisador, da purificação do produto e recuperação da glicerina. Podem ser utilizados na transesterificação de óleos vegetais com altos teores de ácidos graxos livres; Redução significativa do número de etapas de purificação; Possibilita a reutilização do catalisador; Evita a corrosão da planta; Facilita a purificação da glicerina.   Requer maior tempo de reação e temperaturas mais elevadas.   Plantas industriais mais sofisticadas. Heterogêneos

Tecnologia - Craqueamento Produção: 250 l/dia Gases leves CO 2 H 2 O Biodiesel Óleo vegetal 40

Catálise Enzimática A catálise enzimática sintetiza especificamente ésteres alquílicos, permite a recuperação simples do glicerol, a transesterificação de glicerídeos com alto conteúdo de ácidos graxos. As lipases são as enzimas que catalisam a hidrólise de acilgliceróis em ácidos graxos, diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol. As lipases são comumente encontradas na natureza, podendo ser obtidas a partir de fontes animais, vegetais e microbianas. A utilização de uma enzima imobilizada tem como vantagens a inexistência de rejeito aquoso alcalino, menor produção de outros contaminantes, maior seletividade, bons rendimentos, reutilização em outras reações, além de melhorar a estabilidade e atividade da enzima, essas vantagens motivam a realização de pesquisas que visem diminuir a principal desvantagem da metodologia: alto custo das enzimas puras.

ProcessosVantagensDesvantagens Químicos ●Simplicidade ●Alto rendimento ●Curto tempo de reação ●Exigência de baixo teor de ácidos graxos livres e água. Dificuldade de separação do catalisador ●Impossibilidade da reutilização do catalisador ●Obtenção de produtos com menor grau de pureza ●Necessidade de tratamento de água após a transesterificação a quantidade de álcool a ser usado deve ser muito maior que a razão molar da reação, e a evaporação/refluxo do álcool em excesso conduzem a um aumento do consumo de energia. Catálise química X catálise enzimática

ProcessosVantagensDesvantagens Enzimático ●Facilidade da separação do catalisador ●Obtenção de produtos com maior grau de pureza ●Menor temperatura de reações ●Fácil recuperação do glicerol ●Bons rendimentos e alta seletividade. Processo limpo, renovável e seletivo ● Enzimas desenvolvidas para indústria alimentícia: meio reacional emulsificado. Baixa atividade catalítica em meio hidrofóbico. Longo tempo de reação. Alta concentração. ●Custo das enzimas Catálise química X catálise enzimática

HIPÓTESE: uma enzima lipolítica com superfície mais hidrofóbica interage melhor com o substrato em um ambiente livre de solventes polares levando a um rendimento maior na conversão de gordura em biodiesel, quando comparado com Lipases naturais. PROCEDIMENTO: a partir de uma estrutura base, utilizar técnicas de biologia computacional para identificar sítios passíveis de modificação com o intuito de criar uma enzima com maior solubilidade em ambientes hidrofóbicos e que mantenha a função nativa da proteína base.

Exercício 1.Seleção da proteína de interesse em banco de dados públicos como o Protein Data Bank - Lipase B de Candida antarctica (1TCB.pdb). Na forma tridimensional, mostrar a estrutura secundária marcando as folhas beta e as formas alfa-hélice. Colorir a superfície proteica de acordo com potencial eletrostático evidencia os aminoácidos polares (azul) os amino ácidos hidrofóbicos (vermelho). 2.seleção de características físico-químicas e estruturais presentes no banco de dados Blue Star STING; 3.definição de valores limites para cada uma das características selecionadas na etapa dois; 4.Selecionar os aminoácidos da superfície proteica, polares e pouco hidrofóbicos, como alvos para mutação com base em sua distância do sítio catalítico e ao mesmo tempo contendo nenhum contato interno com outros aminoácidos. 5.uso do módulo JPD do Blue Star STING para seleção dos aminoácidos cujas características satisfazem os valores de cada um dos descritores selecionados na etapa dois;

METODOLOGIA: (i) seleção da proteína de interesse em banco de dados públicos como o Protein Data Bank (1TCB.pdb); (ii) seleção de características físico-químicas e estruturais presentes no banco de dados Blue Star STING; (iii) definição de valores limites para cada uma das características selecionadas na etapa dois; (iv) uso do módulo JPD do Blue Star STING para seleção dos aminoácidos cujas características satisfazem os valores de cada um dos descritores selecionados na etapa dois; (v) modelagem por homologia com software Modeller de mutantes com mutações singulares, modificando cada um dos aminoácidos selecionados na etapa quatro, por resíduo de (Alanina) Valina; (vi) monitoramento da variação das propriedades físico- químicas e/ou estruturais dos aminoácidos que compõem o sitio catalítico, através de geração de arquivos em formato “TGZ” pelo servidor do Blue Star STING; (vii) seleção dos melhores mutantes com base no escore V4; (viii) construção de modelos com mutações múltiplas baseadas nos melhores valores de V4 para as mutações singulares estudadas, utilizando o Modeller; (ix) avaliação dos modelos com mutações múltiplas pelo escore V4, comparando com a estrutura nativa; (x) medida da variação da área de superfície hidrofóbica em relação à estrutura nativa da enzima selecionada visando a maximização do parâmetro SHI

1. Abrir no JPD o arquivo 1tcb.pdb 2. OK para janela que pede se eh para ver as duas cadeias 3. Na sequence frame, REFRESH 3 vezes! 4. Abrir SELECT na JPD 5. Relevant Sites/Surface Accessibility/in Isolation ONLY >5 6. Averiguar se a linha de SURF (ondulada verde) esta não interrompida 7. Others/Residue Type/Hydrophilic 8. CONTACTS/ContactsEnergy/AllContacts/InternalEnergy <30 vai ate <14 9. Lista demonstra SGSGSSDGGGTYENGRT 3,4,5,24,28,31,49,60,95,171,217,244, ,292, 307, 309, 316 Patente pediu troca dos: Ser-3, Gly-4, Ser-5, Gly-24, Thr-24, Ala-276, Arg-309 e Thr-316

Solução do exercício e a patente: “METODO PARA SUGESTAO DE MUTANTES QUE AUMENTEM O INDICE DE HIDROFOBICIDADE DA SUPERFICIE DE PROTEINAS MANTENDO PARAMETROS FISICO QUIMICOS MINIMAMENTE ALTERADOS NO SITIO CATALITICO”. Figura 1 – Etapas do processo de geração de mutantes in silico de estruturas protéicas com área de superfície mais hidrofóbica (a esquema apresenta o caminho com e sem passos de minimização de energia dos modelos por dinâmica molecular).

Figura 2 – Estrutura tridimensional em forma “cartoon” da proteína Lipase B de Candida antarctica (1TCB.pdb) mostrando sua estrutura secundária composta por três folhas betas e seis alfa-hélices (a). A superfície proteica colorida de acordo com potencial eletrostático evidencia a quantidade de aminoácidos polares (cinza e cinza escuro) presentes na superfície da enzima estudada – a área em branco apresenta a área ocupada por amino ácidos hidrofóbicos (b). Tabela 1 – Aminoácidos de superfície proteica, polares e pouco hidrofóbicos, selecionados como alvos para mutação com base em sua distância do sítio catalítico da enzima Lipase B de Candida antarctica (1TCB.pdb) e no mesmo tempo contendo nenhum contato interno com outros aminoácidos. Os aminoácidos listados em destaque (fundo cinza) são levemente hidrofóbicos e por isto são considerados como candidatos apropriados para substituição por Valina que é mais hidrofóbica.

Hidropatia Aminoácido (Arg) 0.94 (Gly) (Asp) 1.28 (Cys) (Glu) 1.81 (Ala) (Asn) 2.33 (Trp) (Lys) 2.35 (Met) (Gln) 2.98 (Phe) (His) 3.50 (Pro) (Ser) 4.04 (Val) (Thr) 4.92 (Ile) (Tyr) 4.92 (Leu) Tabela 2 – Escala de hidropatia de acordo com: “Radzicka, A. & Wolfenden, R. (1988). Comparing the polarities of the amino-acids -- side-chain distribution coefficients between the vapor-phase, cyclohexane, 1-octanol, and neutral aqueous-solution. Biochemistry 27, ” Amino ácidos em destaque (fundo cinza) são hidrofóbicos.

1. Energia de contatos nao utilizados; 2. Contatos nao utilizados; 3. Densidade; 4. Area de acessibilidade ao solvente; 5. Esponja; 6. Cross Link Order; 7. Cross Presence Order; 8. Hidrofobicidade; 9. Curvatura local; Tabela 3 – Descritores físico-químico e estruturais usados na análise comparativa entre a estrutura nativa da enzima Lipase B de Candida antarctica (1TCB.pdb) e os modelos mutantes gerados por homologia.

Figura 3 – Comparação entre os parâmetros calculados para o aminoácido Ser-105 (um dos três amino ácidos membros de tríade catalítica de lípase) em proteína contendo mutações e em estrutura nativa da enzima Lipase B de Candida antarctica. A figura está demonstrando para Ser-105 a variação dos valores dos parâmetros listados na tabela 3, encontrados em modelos a onde amino ácidos citados na tabela 1 foram substituídos por Val. Os descritores “acessibilidade ao solvente” e “Cross Presence Order” se apresentam como principais fatores introdutores de variabilidade entre os modelos estudados. Os parâmetros pertinentes a estrutura nativa e aos diferentes modelos se alteram em cor, iniciando com proteína nativa (em preto) e mutante “Ser_3” (em cinza escuro).

Figura 4 – Comparação entre os parâmetros calculados para o aminoácido Asn-187 (um dos três amino ácidos membros de tríade catalítica de lípase) em mutantes, relativo aos valores obtidos para a estrutura nativa da enzima Lipase B de Candida antarctica. A figura está demonstrando para Asn- 187 a variação dos valores dos parâmetros listados na tabela 3, encontrados em modelos a onde amino ácidos citados na tabela 1 foram substituídos por Val. O descritor “acessibilidade ao solvente” se apresenta como principal fator introdutor de variabilidade entre os modelos estudados. Os parâmetros pertinentes a estrutura nativa e aos diferentes modelos se alteram em cor, iniciando com proteína nativa (em preto) e mutante “Ser_3” (em cinza escuro).

Figura 5 - Comparação entre os parâmetros calculados do aminoácido His-224 (um dos três amino ácidos membros de tríade catalítica de lípase) em mutantes, relativo aos valores obtidos para a estrutura nativa da enzima Lipase B de Candida antarctica. A figura está demonstrando para His-224 a variação dos valores dos parâmetros listados na tabela 3, encontrados em modelos a onde amino ácidos citados na tabela 1 foram substituídos por Val. O descritor “acessibilidade ao solvente” se apresenta como principal fator introdutor de variabilidade entre os modelos estudados. Os parâmetros pertinentes à estrutura nativa e aos diferentes modelos se alteram em cor, iniciando com proteína nativa (em preto) e mutante “Ser_3” (em cinza escuro).