DETECÇÃOS DOS GENES gfp E bla POR PCR-multiplex 1 5 de Junho de 2017

Como detectar a transformação de E. coli HB101 com o pGLO ? 2 Ensaios fenotípicos Pesquisa da função dos novos genes adquiridos Ensaios genotípicos Pesquisa da presença dos próprios genes

Que genes foram introduzidos E. coli HB101 ? 3 Gene bla Gene gfp Gene araC ORI

Que genes foram introduzidos E. coli HB101 ? 4 Gene bla Gene gfp Gene araC ORI Gene gfp – Codifica para a proteína fluorescente verde

Que genes foram introduzidos E. coli HB101 ? 5 Gene bla Gene gfp Gene araC ORI Gene gfp – Codifica para a proteína fluorescente verde Gene bla – Codifica uma β -lactamase, ou seja, uma enzima que degrada penicilinas e por isso confere resis- tência a estes antibióticos

Que genes foram introduzidos E. coli HB101 ? 6 Gene bla Gene gfp Gene araC ORI Gene gfp – Codifica para a proteína fluorescente verde Gene bla – Codifica uma β -lactamase, ou seja, uma enzima que degrada penicilinas e por isso confere resis- tência a estes antibióticos Gene araC – Codifica o regulador do operão da arabinose

Teste fenotípico da transformação: 7 Crescimento das colónias em meio selectivo: contendo ampicilina e arabinose

Teste genotípico da transformação: 8 Detecção dos genes por PCR

O que é o PCR? 9 Região a amplificar Adição (annealing) dos primers Primer foward Primer reverse

O que é o PCR? 10 Primer foward Primer reverse Extensão (síntese das novas cadeias)

O que é o PCR? 11

Multiplex PCR Uma variação ao PCR em que um par de primers amplifica apenas uma região do DNA molde, pode-se usar vários pares de primers para amplificar várias regiões do MESMO DNA molde ! 12

multiplex-PCR 13 2ª Região a amplificar Annealing Fw-2 Rv-2 Fw-1 Rv-1 1ª Região a amplificar

multiplex-PCR 14 Fw-2 Rv-2 Fw-1 Rv-1

Electroforese dos produtos de PCR 15

Electroforese dos produtos de PCR 16

Electroforese dos produtos de PCR 17

Electroforese dos produtos de PCR 18 Aplicar corrente eléctrica (+) (-) 90 V

Electroforese dos produtos de PCR 19 Aplicar corrente eléctrica (+) (-) 90 V

Extracção de DNA total Pegue em 3 microtubos de 1,5 mL e escreva o nome do seu grupo em cada um deles, e depois num deles escreva simplesmente 1 (E coli HB101), noutro 2 (E coli HB101 + pGLO) e no outro 3 (branco) Use uma para cada operação uma PONTA AMARELA ESTÉRIL nova e pipete, com uma micropipeta P100 (amarela), 50 µL de água estéril para cada um dos 3 tubos Colher uma colónia bem isolada de cada placa de petri, tocando com uma ansa ESTÉRIL em cima da colónia e transferindo para o tubo respectivo, agitando até que as células se dissolvam completamente. Repita o processo para cada estirpe. Feche os microtubos e coloque-os num microondas à intensidade máxima durante 2 minutos Guardar microtubos a -20 ºC até usar. 20

Preparação do PCR Use um microtubo de 1,5 mL limpo e estéril - escreva a palavra MM (master mix) e o número do grupo (ex.: MM-G1) Depois mudando SEMPRE de ponta use as micropipetas para transferir os reagentes do master mix do PCR para cada um dos tubos, segundo a tabela seguinte: NOTA: mantenha o MAIS possível os reagentes no FRIO/gelo !!! 21 ReagenteMM (µL) PCR 10x buffer6 50 mM MgCl mM dNTPs2 GFP FW (5’-tctgtaacaaagcgggacca-3’)1 GFP RV (5’-cgacaaacaacagataaaac-3’)1 Bla FW (5'-atgagtattcaacatttccg-3’)1 Bla RV (5'-ttactgtcatgccatcc-3')1 50 U TAQ3 ddH 2 O42

Misture gentilmente os MM e faça uma centrifugação rápida. Guarde imediatamente os reagentes no congelador e coloque os MM em banho de gelo; Escreva o nome do seu grupo e os números 1, 2 e 3 em microtubos de PCR (0,2 mL); Transfira 20 µL do MM para cada microtubo; Finalmente, e sempre com uma PONTA ESTÉRIL NOVA, pipete 5 µL de DNA E. coli HB101 para cada um dos microtubos 1; 5 µL de DNA E. coli HB101:pGLO para cada um dos microtubos 2; 5 µL de ddH 2 O para cada um dos microtubos 3; Repita o passo 1 22

Electroforese Pese 0,42 g de agarose, coloque-a num matraz de 250 mL e dilua em 60 mL de tampão 1xTAE (a agarose não se dissolve completamente à temperatura ambiente); Coloque o matraz no microondas na posição máxima, até que a solução comece a borbulhar (mais ou menos 90 segundos); Deixe a solução arrefecer até mais ou menos 55ºC e adicione 3,0 µL de SYBR green; Coloque o gel no molde sem deixar ficar borbulhas; Não esquecer de colocar o pente; Deixar que o gel polimerize e enquanto se espera retirar os tubos de PCR da aula anterior do congelador; Fazer uma réplica de cada tubo, colocando 2µL de tampão de amostra com azul de bromofenol (loading dye) com 8 µL de produto amplificado por PCR e agite suavemente – para cada amostra, mude de ponta; 23

Colocar 10 µL da mistura anterior em cada poço do gel e 10 µL de DNA ladder (marcador de peso molecular) em cada poço das extremidades do gel. Imergir o gel polimerizado no tampão a 1xTAE, dentro sistema de electroforese; Fechar o sistema e correr durante 70 m a 110 Volts; Desligar o aparelho e retirar o gel do sistema e colocá-lo sobre o transiluminador de UV; Fotografar e registar os dados (o produto amplificado de bla tem 756 pb e o produto gfp tem 310 pb); Descartar o gel num contentor apropriado 24