Enzimas de restricción INGENIERÍA GENÉTICA

¿Qué son las enzimas de restricción?  tijeras moleculares que cortan las moléculas de ADN de doble cadena en puntos específicos.  Se encuentra naturalmente en una amplia variedad de procariotas  Son una herramienta importante para la manipulación de ADN.

Descubrimiento  Arbor y Dussoix en 1962 descubrieron que ciertas bacterias contienen endonucleasas que tienen la capacidad de escindir el ADN.  En 1970 Smith y colegas purificado y caracterizado el sitio de escisión de un enzima de restricción.  Werner Arbor, Hamilton Smith y Daniel Nathans compartieron el Premio Nobel de Medicina y Fisiología 1978 por su descubrimiento de las enzimas de restricción.

El papel biológico de las enzimas de restricción  La mayoría de las bacterias utilizan enzimas de restricción como una defensa contra los bacteriófagos.  Las enzimas de restricción prevenir la replicación del fago mediante la escisión de su ADN en sitios específicos.  El ADN del huésped está protegido por metilasas que añadir grupos metilo a la adenina o citosina bases dentro del sitio de reconocimiento modificando de este modo el sitio y proteger el DNA.

Mecanismo de acción Restricción La endonucleasa explora la longitud del ADN, se une a la molécula de ADN cuando reconoce una secuencia específica y hace un corte en cada una de las espinas dorsales del azúcar fosfato de la doble hélice - hidrolizando el enlace fosfodiester. Específicamente, el enlace entre el átomo 3 'O y el átomo P se rompe.

Secuencias palindromicas Las enzimas de restricción reconocen y hacen un corte dentro de secuencias palindrómicas específicas, conocidas como sitios de restricción, en el ADN. Esta es normalmente una secuencia de 4 o 6 pares de bases. Una secuencia palindrómica en el ADN es aquella en la que la secuencia de pares de bases de 5 'a 3' es idéntica en ambas cadenas.

Las enzimas de restricción reconocen y hacen un corte dentro de secuencias palindrómicas específicas, conocidas como sitios de restricción, en el código genético. Normalmente es una secuencia de 4 o 6 pares de bases.

Ejemplo Es una enzima de restricción que busca la molécula de ADN hasta que encuentra esta secuencia de cuatro bases nitrogenadas. 5’ TGACGGGTTCGA GGCC AG 3’ 3’ ACTGCCCAAGGT CCGG TC 5’

Una vez que el sitio de reconocimiento fue encontrado HaeIII podría ir a trabajar cortando (dejando) el ADN Estos cortes producen lo que los científicos llaman "extremos romos"

Tipos de cortes Los fragmentos de restricción pueden ser extremos romos o extremos pegajosos 5’ TGACGGGTTCGAGGCCAG 3’ 3’ ACTGCCCAAGGTCCGGTC 5’ 5’ TGACGGGTTCGAGGCCAG 3’ 3’ ACTGCCCAAGGTCCGGTC 5’ Pueden usarse extremos pegajosos o extremos romos para unir fragmentos de ADN. Los extremos pegajosos son más cohesivos en comparación con los extremos romos. Extremo pegajoso Extremo romo

Isosquizómeros y Neochischizómeros  Las enzimas de restricción que tienen la misma secuencia de reconocimiento así como el mismo sitio de escisión son isosquizómeros.  Las enzimas de restricción que tienen la misma secuencia de reconocimiento pero escinden el ADN en un sitio diferente dentro de esa secuencia son neoquizómeros. Por ejemplo: SmaI y XmaI

Tamaño de los fragmentos de restricción Los fragmentos generados a través de la digestión por enzimas de restricción pueden ser analizados con la técnica de electroforesis agarosa.

Tipos de enzimas de restricción

Nomenclatura para las enzimas de restricción EcoRI por ejemplo R de la bacteria E. coli I como es la primera enzima de restricción de E. coli que se descubrió. 1º. Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo (ej. Escherichia coli (Eco); Haempphilus influenzae (Hin) ) 2º. La cepa o estirpe si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa RY13 de E. coli ) 3º. En números romanos, un número para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima de restricción. 4º. Todas deberían llevar delante una R de restricción o un M de metilasa según la función de la enzima, pero generalmente se omite.

Estructura de las endonucleasa EcoRI  Consiste en dos subunidades - dímeros relacionados por simetría rotacional doble.  Se liga a la simetría coincidente de la molécula de ADN en el sitio de restricción y produce una torcedura en el sitio.

Usos de las enzimas de restricción  Las enzimas de restricción se pueden utilizar para generar un mapa de restricción. Esto puede proporcionar información útil para caracterizar una molécula de ADN. MAPAS DE RESTRICCIÓN Un patrón de ADN generado mediante electroforesis que se produce después de cortar con una enzima de restricción. La representación de una molécula de ADN, ya sea circular o lineal, donde se indiquen los sitios de restricción que poseen, se denomina mapa de restricción.

Usos….  Las enzimas de restricción son las más utilizadas en la tecnología del ADN recombinante

References  Biochemistry (1995), Wiley & Sons, Inc. Voet D. and Voet J.G.  Biochemistry (2002), Freeman & Co. Berg, J.M., Tymoczco, J.L., Stryer, L.  An Introduction to Genetic Analysis (2000), Freeman & Co. Griffiths, A., Miller, J.H., Suzuki, D.T., Lewontin, R.C., Gelbart, W.M.  Molecular Cell Biology (2000), Freeman & Co. Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaria, Baltimore, Darnell