05 / 04 / Immunomarquages Principe d’un immunomarquage Principe  L'examen immuno-histochimique (IHC) consiste à révéler sur coupe histologique, par réaction antigène-anticorps, la présence de récepteurs antigéniques cellulaires intranucléaires, membranaires ou cytoplasmiques.  Spécificité de liaison antigène-anticorps. L’anticorps dit primaire est ensuite révélé par un anticorps secondaire spécifique conjugué à un fluorophore ou à une enzyme afin de révéler et d’amplifier le signal

05 / 04 / Immunomarquages Principales difficultés Bruit de fond = ratio signal/bruit médiocre  Enzymes endogènes (peroxidases…), autres molécules (biotine, …) -Observation d’un contrôle négatif sans anticorps primaire mais avec l’anticorps secondaire et le substrat de révélation pour identifier le bruit de fond endogène -Solution: bloquer les activités enzymatiques (H2O2 in methanol or water pour la PER, levamisole pour la PAL)  Artéfact technique -problème de la fixation au formol et surtout de l’inclusion en paraffine pour l’observation en fluorescence

05 / 04 / Immunomarquages Principales difficultés Signaux non-spécifiques Lipofuscin Background in Nervous System Tissue. Lipofuscin is a pigment that accumulates with age in many tissue types. It also has autofluorescent properties that overlap with excitation and emission spectra of commonly used fluorochromes.  Pigments tissulaires : lipofuscine, hémosidérine

05 / 04 / Immunomarquages Principales difficultés Signal non-spécifique  Pigments tissulaires -Observation d’un contrôle négatif sans réactifs pour identifier le bruit de fond endogène  manque de spécificité de l’anticorps et réactions croisées -caused by non-specific interactions of immunoglobulin molecules with the sample -quand cela est possible, utilisation de différents anticorps dirigés contre la protéine recherchée pour confirmer les résultats -gamme de dilutions des anticorps primaires et secondaires pour déterminer les concentrations optimales et minimiser les marquages non spécifique -Observation d’un contrôle isotypique. can be utilized when working with monoclonal primary antibodies. The sample is incubated with antibody diluent, supplemented with a non-immune immunoglobulin of the same isotype

05 / 04 / Immunomarquages Principales difficultés Signal non-spécifique  Pigments tissulaires -Observation d’un contrôle négatif sans réactifs pour identifier le bruit de fond endogène  manque de spécificité de l’anticorps et réactions croisées -caused by non-specific interactions of immunoglobulin molecules with the sample -Observation d’un contrôle isotypique. can be utilized when working with monoclonal primary antibodies. The sample is incubated with antibody diluent, supplemented with a non-immune immunoglobulin of the same isotype -Observation d’un contrôle d’absorption. To demonstrate that an antibody is binding specifically to the antigen of interest, it is first pre-incubated with the immunogen (1:10). This should inactivate the antibody and the tissue should show little or no staining.

05 / 04 / Immunomarquages Validation d’un marquage Controles Témoins  témoins positifs et négatifs : même tissu, même espèce Attention à la transposition des résultats obtenus en Western blot ou en tri cellulaire

05 / 04 / Immunomarquages IHC versus IF IHC fluorescente = IFIHC chromognéique Observation au microscope à épifluorescence ou au confocal Observation au microscope en champs large (lumière blanche) Multimarquage (<6)Marquage simple voiremultiple (jusqu’à 4 en multiplex) si absence de colocalisation Préparations relativement fragiles (lumière, température) -> observation rapide Préparations stable Utilisation de prélèvements congelés pour limiter auto-fluorescence Prélèvements fixés ou congelés Architecture tissulaire non visible (noyaux seuls en général) Architecture tissulaire visible Quantification de l’intensité de signal possible Pas de quantification du signal possible (saturation) Utilisation de logiciels d’analyse d’image pour quantification de l’abondance d’un signal Utilisation difficile de logiciels d’analyse d’images (superposition des spectres d’émission)

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