פרויקט בקורס מבוא לביואינפורמטיקה חיפוש מנגנון בקרת ביטוי חדש בטפילים פוליציסטרונים ובחד תאים נמוכים, הפועל על עיקרון מנגנון unfolded protein response בשמר וביונקים. מיכל מעוז גיל רובין

אולם איך מבוטאים בזמן העקה רק חלק מהגנים מתוך יחידת RNA גדולה?? מנגנוני בקרת ביטוי בטפילים פוליציסטרונים Leishmania, ו-trypanosoma, הם טפילים חד תאיים פוליציסטרונים. אורגניזמים אלה ייחודיים באופן אירגון הגנום: - גנים המקודדים לחלבונים שונים ערוכים ברצף ועוברים שעיתוק כיחידה אחת. - הבקרה על רמת החלבונים בשלבי ההתמינות של אורגניזמים אלו נעשית בעיקר לאחר השיעתוק. ידוע כי התמינות הטפילים מתרחשת בתנאי עקת חום. אולם איך מבוטאים בזמן העקה רק חלק מהגנים מתוך יחידת RNA גדולה??

מנגנון unfolded protein response בשמר 1. חלבון Ire1 מוחזק ע"י צ'אפרון. 2. בזמן עקה חלבונים ב-ER עוברים misfolding. 3. הצ'אפרונים עוזבים את ה-Ire. 4. Ire1 עובר דימריזציה וזרחון עצמי. 5. Ire1 חותך intron ב-mRNA של פקטור השיעתוק HAC1. 6. HAC1 מתורגם לחלבון. 7. חלבון HAC1 גורם לביטוי גנים הנדרשים לטיפול בעקה.

חלבון Ire1 – מנגנון ייחודי לחיתוך RNA מבנה ייחודי: דומיין קינאז ואחריו דומיין אנדוריבונוקלאז. קינאז חיתוך RNA: זרחון הקינאז גורם להפעלת דומיין אנדוריבונוקלאז שמזהה intron שבקצותיו שני מבני stem-loops ב- HAC1, וחותך אותו ללא תיווך של spliceosomes. אנדוריבונוקלאז HAC1 – mRNA: נמצא בתא כל הזמן, ורק בזמן עקה, לאחר החיתוך על-ידי Ire1 מתבטא לחלבון.

הגדרת הבעיה מטרתינו היא חיפוש הומולוגים לחלבון ה-Ire1 ולאיזור החיתוך של HAC1-mRNA בחד תאים אאוקריוטים נמוכים בכלל, ובטפילים בפרט. מציאתם תוכל לרמז על קיום מנגנון בקרה שלאחר שיעתוק חדש, אשר בתנאי עקה גורם לחיתוך אזורים ספציפיים ב- RNA אשר מוביל לביטוי גנים האחראים לשינויים ההתפתחותיים הנדרשים בטפיל. animals fungi plants ciliates Slime molds flagellates

דרך העבודה והכלים הומולוגים ל-Ire1: בחירת חלבונים להשוואה מתוך אורגניזמים רלוונטיים על ידי standard protein-protein Blast על ה-Ire1. חקירת איזה חלק מתוך אזורי ההתאמה המקומיים שהתקבלו על ידי ה- Blast שייכים לדומיין הקינאז של ה-Ire1 , איזה חלק שייך לדומיין האנדוריבונוקלאז שלו, ואיזה חלק שייך לדומיינים האחרים על ידי Swiss port . חיזוי המבנה השניוני של ה-Ire1 ושל החלבונים המושווים על ידי Psipred. השוואת המבנים השניוניים שהתקבלו בדגש על הדומיינים קינאז ואנדוריבונוקלאז.

דרך העבודה והכלים הומולוגים ל-HAC1: חיפוש הומולוגים באורגניזמים רלוונטיים על-ידי standard nucleotide nucleotide Blast על רצף ה- HAC1. חיזוי מבנה שניוני של ה- RNA Hac1 על ידי MFOLD וחיפוש מבנים דומים של RNA באורגניזמים הרלוונטים, בעיקר באזור הנחתך על ידי ה-Ire1.

תוצאות החלבונים הנבחרים: putative mitogen-activated protein kinase kinase 2 [Leishman mexicana [ putative protein - strong similarity to unknown protein [[Diktyostlium discoideum Calcium-dependent protein kinase [[ Plasmodium falciparum  

תוצאות Blast לחלבונים הנבחרים: Plasmodium 67.8 8e-10 580 Diktyostlium 157 8e-37 1431 Leishmania 69.3 2e-10 1090 האורגניזם Score E-value מספר חומצות אמיניות

תוצאות השוואת ההתאמות לפי דומיינים: Leishmania: כל ההתאמות התקבלו בדומיין הקינאז. Diktyostlium: 71% מההתאמות התקבלו בדומיין הקינאז, ו- 29% התקבלו בדומיין האנדוריבונוקלאז. Plasmodium: 82% מההתאמות התקבלו בדומיין הקינאז, ו - 18% התקבלו בדומיין האנדוריבונוקלאז.

תוצאות השוואת מבנים שניוניים: בכל החלבונים התקבל דמיון רב במבנה השניוני ל-Ire1 בדומיין הקינאז. (צפוי....)

השוואת המבנה השניוני בדומיין האנדוריבונוקלאז של ה-Ire1: חלבון ה- Diktyostlium: באזור זה נמצא דמיון רב באופן יחסי בין המבנים השניוניים אשר נחזו לשני החלבונים. CCCC CCCCCCCCCCCCCCCCC CCCHHHHHHH CCCCCCC CCCCCCCCCCCHHHHHHHHHHH CCCCC HHHH Ire1: FWPKSKKLEFLLKVSDRLEIEN RDPPSALLMKF DAGSDFV IPSGDWTVKFDKTFMDNLERYRKYH S SKLMDL FW + +K++F + L+ N + S LL + D + S W D + D++ E Y ++ DL Ddp: FWSTNEK IKFYESSLNLLKDPNNSQSKHSKLLNYYQNDNSGGVLFLSKPWNQI IDPFL I DHVENNNAYQYDYQVRDL CCCCCCC CCCCCCCCCCCCCCCCCCHHHHHHHHH HHCCCCCCCCCCCHHHCCC HHHHHHHCCCCCCCCCHHHHH   HHHHHHHCCCCCCCCHHHHHHCCCCC C CCCCHHH H CCCH HH H H HHHHHHHH Ire1: LRALRNKYHHFMDLPED I AELMGPVP D GFYDYF T K R FPN L L I G VYM IVKEN +R + RN H D+ I + P + YF + F P+ L L +Y K++ Ddp: VRC I RNSLVHHKD I LRS I TQQQ NLP P S S KE F AN DCLK S QE SV LL YF E C KF PD L L F HLY QQF KKS HHHHHHHHHHHHHHHH HHHHCCCC HHH HH HHC C CCCC CC CHHH HHH H HCCHH H HHHHH HHHHC עובדה זו בצירוף תוצאות הדמיון במבנה הראשוני של דומיין זה מחזקת את ההשערה כי לחלבון זה עשוי להיות תפקיד דומה לזה של חלבון ה- Ire1 .

השוואת המבנה השניוני בדומיין האנדוריבונוקלאז של ה-Ire1: חלבון ה- Plasmodium : התקבל דמיון מסוים במבנה השניוני, אך לא ניתן לומר האם זהו דמיון משמעותי. CCCCCCCC CC CC CCC CCCC CCCCCCHHHHHHHHCC CCCC CCC CCCCCC CC CCHHH Ire1: FWPKSKKLE F L LKV S DRLE I ENRDPP SA LLMKF DAGSDF V IP SGDWTV KF DKTFM W K KK F + + + + LL+ KF + + I S D+ V K TF+ Pfp: WFKKKKYAFNMDMKMDIHVLE NFKN YGLLLKFQKL AMT I I AQQSNDYDVEK LKS TF L CCC CCCCCCC CC CC CCCCCHHHHCCHHHCCHHHHHHHHHHHCCCCHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHCCCCCHHHHHHHHHHHCCCCCCCCHHHHHHCCCCCCCCCCHHHHCCCHHHHHHHHHHHHHCCCCHHHHHHCCC Ire1: DNLERYRK YHSSKLMDLL RALRNKYHHFMDLPED I AELMGPVPDGFYDYFTK RFP NLL I GVYM IVKEN LSDDQ I LRE F LYS Pfp: VLDEDGKGY I TKEQLKKG LEKDGLKLPYN FDLLL DQ IDS DGSGKI DYTEFI A AALDRKQLS KK LI YCAFRV FDVDNDGE IT HCCCCC CCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HH HCCCCCCEE EHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCC CC

השוואת המבנה השניוני בדומיין האנדוריבונוקלאז של ה-Ire1: חלבון ה-leishmania: התקבל דמיון חלש בלבד במבנה השניוני בדומיין זה.

תוצאות חיפוש הומולוגים ל-HAC1 mRNA חיפוש לפי הרצף לא הניב אף תוצאה משמעותית. חיפוש לפי מבנה שניוני:

מסקנות סביר כי ה- Hac1 אינו סובסטרט ייחודי מבחינת רצף הנוקלאוטידים שלו עבור יכולת החיתוך של ה- Ire1 . אי מציאת הומולוגים לא שוללת הימצאות RNA הנחתך בצורה דומה בטפילים ובחד תאים נמוכים.

מסקנות טפיל ה-leishmania (הפוליציסטרונית) - לא נתגלו רמזים המעידים על קיום מנגנון בקרה חדש בניגוד להשערתינו. טפיל ה-Plasmodium - התוצאות אינן משמעותיות במידה מספקת. לא ניתן להסיק מהן על קיום או אי קיום של המנגנון המבוקש. חד התא Diktyostlium - נמצאו סימנים משמעותיים למדי כי החלבון שהושווה דומה במבנהו ובתפקידו ל- Ire1 ולכן ייתכן כי בזמן עקה הוא נוטל תפקיד בבקרת ביטוי גנים הדרושים להתמיינות, על ידי חיתוך ספציפי של RNA .

מסקנות animals fungi plants ciliates Slime molds flagellates

כיווני מחקר עתידיים מחקר ביולוגי אשר יאשר את השערתנו לגבי תפקידו של החלבון ב- Diktyostlium. פתרון המבנה השלישוני של Ire1, ושל החלבונים שחקרנו, והשוואתם.

סוף!