Diagnosticul in Tuberculoza Grigoriu Bogdan Ianuarie 2009

Metode de diagnostic Examenul bacteriologic Examenul histopatologic Testarea cutanata tuberculinica

Examenul bacteriologic Microscopie optica (evidentierea BAAR) Sensibilitate 10000 bacili / ml Cultura micobacteriilor si identificarea speciei Metoda de electie Sensibilitate 100 bacili / ml Inocularea la cobai Costisitoare, lenta, doar in cercetare Sensibilitate 1-10 bacili / ml Ne vom referi in continuare doar la primele doua

Probe clinice TB pulmonara (contaminate) TB extrapulmonara (sterile) Sputa spontana sau indusa cu aerosoli Mai rar alte TB extrapulmonara (sterile) Lichid pleural, peritoneal, pericardic Lichid cefalorahidian Lichid articular Urina Fragmente bioptice Se va sublinia diferenta dintre secretiile respiratorii contaminate si celelalte produse ce trebuie recoltate steril; in plus se va sublinia importanta cultivarii tuturor fragmentelor bioptice de la pacienti suspecti de TB INAINTEA introducerii in formol.

Coloratia Ziehl-Neelsen Examenul microscopic Coloratia Ziehl-Neelsen Este metoda Standard de diagnostic Identifica Mycobacteriile evidentiind proprietatea de acid –alcoolo-rezistenta (nu este specifica de gen) Citirea lamelor este relativ laborioasa: examinarea - la MO cu obiectiv cu imersie 100x ; Se numara BAAR pe 100 de campuri MB - bastonase subtiri, rosii, usor incurbate, mai mult sau mai putin granulare, izolate sau grupate în perechi, pe fond albastru

Recoltarea probelor de sputa Clatirea gurii cu apa pentru indepartarea resturilor alimentare 2 inspiratii profunde urmate de retinerea respiratiei dupa fiecare dintre ele timp de cateva secunde, apoi o a treia inspiratie profunda, urmata de un expir fortat. Se declaseaza tusea care va usura expectoratia Depunerea sputei in recipientul/flaconul care se tine lipit de buze(diam minim 3-4cm) Fixarea stransa a capacului prin infiletare Spalarea pe maini cu apa si sapun Se recolteaza 3 probe pentru fiecare control bacteriologic: 2 sub supraveghere medicala si una din prima sputa emisa spontan dimineata Sensibilitatea creste cu volumul de sputa recoltat MINIM 5ml

frotiu de sputa ce arata pe langa celule si alte resturi colorate in albastru si numerosi bacili colorati in rosu adica BAAR (Ziehl-Nielsen, 1000x)

Sensibilitatea metodei este destul de redusa : Daca bacilii sunt distribuiti uniform: Volumul de sputa pe lama = 0,01 ml Lama are 10.000 campuri Pentru a gasi 1 bacil pe 100 campuri = 10.000 bacili/ml 1 bacil pe 10 campuri= 100,000 bacili/ml 1 bacil pe fiecare camp=1,000,000 bacili/ml Doar 100 -200 de campuri sunt examinate (1% din lama) Sensibilitatea creste prin examinareamai multor lame (probe de sputa) 1= 80%, 2 = 10-15%, 3= 5-10% 50-70% din TB sunt + la ex direct Pt un examen pozitiv sunt necesari aprox. 10,000 bacili//ml The minimum number of acid-fast bacilli necessary to produce a positive smear result has been estimated to be between 5 000 and 10 000 per millilitre. Sputum specimens from patients with pulmonary tuberculosis - particularly those with cavitary disease - often contain sufficiently large numbers of acid-fast bacilli to be readily detected by direct microscopy. The sensitivity can further be improved by examination of more than one smear from a patient. Many studies have shown that examination of two smears will on average detect more than 90% of infectious tuberculosis cases, both in low- and high-prevalence countries. The incremental yield of acid-fast bacilli from serial smear examinations has been shown to be 80%-82% from the first, 10-14% from the second and 5-8% from the third examination. Smear sensitivity is very low in extrapulmonary and childhood tuberculosis and in most cases of disease caused by mycobacteria other than tubercle (MOTT) bacilli. In high-prevalence countries these conditions are, however, far less common than pulmonary tuberculosis and are not rapidly progressive or highly infectious. From a public health perspective, infectious pulmonary cases have the highest priority for detection and treatment until cure.

Rezultate semicantitative Numar BAAR Rezultat absenti negativ 1-9 BAAR / 100 campuri nr. exact BAAR 10-99 BAAR / 100 campuri + 1-9 BAAR / 1 camp ++  10 BAAR / 1 camp +++ Se poate preciza ca in cazul gasirii a doar 1-2 bacili pe 100 campuri se mai citesc inca 200 si in cazul in care raman 1-2 bacili pe 300 de campuri (deci sub 3 bacili pe 300 de campuri) rezultatul este considerat neconcludent si se va repeta proba). Marire 1000x (obiectiv cu imersie)

Coloratii fluorescente Examenul microscopic Coloratii fluorescente Rapide ( 15 min pe ZN = 2 min pe Auromina-rhodamina) se xamineaza la x 25 (x100 pt Z-N) Necesita energie electrica iar microscoapele sunt mai scumpe (x 3) – rezolvat prin noile tehnici de LED fluorescence Rezultatul pozitiv necesita confirmare prin Z-N Rolul coloratiilor fluorescente in eliminarea lamelor negative, diminuand numarul de lame colorate cu Z-N

coloratie cu auramina O vizualizata in microscopul cu fluorescenta, 1000x

Utilitatea examenului direct Extrem de rapid Poate fi facut oriunde (apa+lumina naturala+foc) Specificitate f buna Mai ales in zonele de endemie mare si HIV scazut (>98%) Repoductibilitate buna > 94% Se coreleaza foarte bine cu infectiozitatea !!!

Erori la examenul direct Rezultate fals pozitive Particule AAR – hrana, erori de colorare (precipitare) BAAR nonpatogeni din mediu mycobacterii netuberculoase patogene Nocardia sp., Spori de bacilus subtilis, fibre polen, fungi Contaminari prin transfer be bacilede pe o lama pe alta Rezultate false negative Colectarea si stocarea improprie a sputei Tehnica de preparare a frotiului deficitara Erori Administrative Erori de etichetare si identificare a specimenelor

Cultura micobacteriilor Metoda standard de diagnostic al TB (documenteaza in plus 20 – 30% din cazuri) Permit identificarea speciei Permit ulterior testarea sensibilitatii Mult mai sensibile Medii solide, de ex. Lowenstein-Jensen (medii pe baza de ou + glycerol si asparagina) Standard Crestere in 4-6 saptamani minim 100 bacili /proba Medii lichide (agar + albumina sau ser bovin) Rapide (incepand de la cateva zile) 10 bacili/poba Mult mai scumpe

Coloniile de MTB pe medii solide sunt rotunde, galben palid, conopidiforme, cu suprafata rugoasa,izolate sau confluente în functie de densitatea bacililor din inoculul initial. Exprimarea rezultatelor se face semicantitativ în functie de densitatea coloniilor. Identificarea speciei se realizeaza prin teste biochimice. Culturi de Mycobacterium tuberculosis pe mediul Lowenstein-Jensen

Testarea sensibilitatii Dificila, costisitoare, grevata de erori Rezistenta MTB la antituberculoase este definita cantitativ (> 1% bacili rezistenti) Este obligatorie: Pentru izoniazida si rifampicina La retratament sau in suspiciunea de chimiorezistenta initiala Trimiteri pentru mai tarziu pentru importanta drogurilor majore si respectiv indicatiile testarii sensibilitatii

Examenul histopatologic Probe clinice Fragment pleural (biopsie pe ac, mai rar toracoscopica) Ganglion Fragment pericardic sau peritoneal Os sau membrana sinoviala Perete bronsic, laringe, plaman Rar alte A se reaminti importanta cultivarii unor portiuni din aceste fragmente, INAINTEA introducerii in formol, intrucat cultura MTB constituie cel mai important argument diagnostic pentru TB.

Fotografie macroscopica pe sectiune de plaman observandu-se o cavitate cu cazeum (alb) in interior

granulom gigantoepitelioid la nivel pulmonar (sageata) cu o zona intinsa de necroza cazeoasa (zona amorfa roza din centrul imaginii), 100x pe slide-ul urmator puteti vedea imaginea marita

fragment pleural cu un granulom epitelioid fara necroza cazeoasa, 100x

Testele Imunologice Testarea cutanata la tuberculina: Serologia – evaluaza raspunsul umoral (anticorpii) la infectia cu M. tuberculosis Sensibilitate si specificitate slabe INUTILA IN PRACTICA Evaluarea immunitatii celulare – teste ce masoara productia de mediatori ai inflamatiei dupa stimularea cu antigene SECIFICE M. tuberculosis (interferon gamma in special) The TB skin test it is misleading – gives false negative –up to 47% for active diseases - and false positive results The interferon gamma- between 20-47% of pts. with extensive disease might be anergic

Testarea cutanata tuberculinica = injectarea strict intradermica de antigene din MTB (denumite PPD = derivat de proteina purificata) ce provoaca o reactie de hipersensibilitate intarziata ce consta in acumularea locala de limfocite si macrofage exprimata macroscopic printr-o induratie la locul injectarii Prima tuberculina a fost produsa de Robert Koch Utilizarea pentu detectia infectiei a fost descrisa pentru prima data de von Pirquet in 1907

Intradermoreactia (IDR) la tuberculina intradermoreactia la tuberculina in stanga puteti observa tehnica de administrare strict intradermic cu formarea unei papule albe (se observa mai bine in imaginea marita din centru) in dreapta citirea cu ajutorul unei rigle a diametrului transversal al induratiei, aici de 12 mm; subliniati importanta masurarii induratiei si nu a eritemului, a diametrului transversal si nu a celui longitudinal si momentul ideal de 72 de ore a citirii, in orice caz nu imediat, precum si necesitatea identificarii cu cat mai mare precizie a marginilor transversale ale induratiei. Intradermoreactia (IDR) la tuberculina

Evaluarea induratiei Se utilizeaza si aspectul calitativ al reactiei - scara Palmer -tip l - induratie ferma,flictene -tip ll- induratie elastica -tiplll- induratie depresibila -tiplV- fara induratie Variabilitatea interindividuala este destul de mare si aduce putine informatii in plus fata de masurarea diametrului transversal al induratiei

Rezultate Pozitiva (infectie tuberculoasa)  10 mm  5 mm la cei infectati HIV Negativa (absenta infectiei tuberculoase) < 10 mm < 5 mm la infectati HIV Detecteaza doar infectia, nu face ≠ dintre infectie si boala DAR intensitatea raspunsului este corelata cu riscul de boala !! A se sublinia relativitea interpretarii la populatiile vaccinate BCG si faptul ca sunt numeroase rezultate fals pozitive si fals negative – vezi slide-urile urmatoare.

Rezultate la testari succesive Viraj tuberculinic = pozitivarea reactiei cutanate la tuberculina Diagnostic de infectie tuberculoasa recenta Salt tuberculinic = cresterea cu minim 10 mm a diametrului reactiei cutanate la tuberculina Semnificatie incerta

Rezultate false Fals pozitive Fals negative Vaccinare BCG Contact cu micobacterii atipice Fals negative Erori de tehnica (inject s.c) Sarcoidoza activa, boli hematologice maligne, infectii virale acute (oreion), vaccinari antivirale cu virus viu, infectia HIV subnutritie, copii< 6 luni-sistem imun imatur. Tratamente imunosupresoare de durata (corticoterapia) Faza initiala a infectiei tuberculoase efect Boost-la batrani: repetarea reactiei la 2-3 sapt./repetarea cu 10 U.I.PPD

Determinarea raspunsului imun antiTB Measurement of induration and erythema IFN-γ Presentation of myobacterial antigens TNF-α IL-8,etc Skin test In-vitro blood test Memory T cell IFN-γ TNF-α IL-8,etc Antigen presenting cell Measurement of IFN-γ production Bazate pe secretia de IFNg de catre leucocitele periferice (celule T?) stimulate cu Ag specifici MTB (ESAT-6, CFP-10, TB7.7)

Testele IGRA (TIGRA) Se exprima ca – pozitiv, negativ, indeterminabil Usor de realizat ( o singura consultatie) – rezultat in 24 h Mai scumpe decat IDR Mai specifice (rata de fals pozitivi mai redusa) Foarte probabil mai sensibile fara reactie booster, nu este afectat de vaccinare BCG anterioara Inlocuiesc treptat IDR Datele preliminare arata o predictie buna a infectiei recente in populatia vaccinata Mai sunt necesare studii in populatii speciale (copi, imunodeprimati etc)

Biologia moleculara Pentru diagnosticul de boala (identificarea MTB) In specimenele BK+ la direct permite confirmarea RAPIDA a genului MTB In specimenele BK- performanta diagnostica este modesta Sensibilitate 70% fata de cultura Specificitate buna/f buna Rapiditatea dg nu compenseaza erorirle si pretul ridicat B. Permite evaluarea rapida a sensibilitatii dupa realizarea culturii primare

Standardul diagnostic Toate persoanle care tusesc de peste 3 saptamani si care nu au o cauza identificata tusei TREBUIE evaluate ca suspecte de TB Toate persoanele care au leziuni radiologice compatibile cu Tb trebuie sa li se recolteze sputa pentru ex direct/cultura chiar daca istoricul de TB este cunoscut Daca leziunile radiologice sunt evolutive sau nu exista o radiografie “de referintaëxamenulsputei trebuie facut indiferentde examenele anterioare Toti pacientii (adulti, adolescenti sau copii) caresunt capabili sa expectoreze TREBUIE sa li se recolteze minim 2 preferabil 3 probe de sputa. Cel putin o proba de sputa trebuie sa fie recoltata dimineata

Standardul diagnostic Daca o localizare extrapulmonare este suspectata trebuie obtinute probe din leziunea suspecta pentru : Ex direct (in cazul lichidelor) cultura si histopatologie; Realizarea examenului histopatologic nu elimina necesitateaculturii probei bioptice !!! Diagnosticul de TB negativa la examenul direct trebuie sa fie bazat pe: Cel putin trei sputenegative Prezenta de leziuni radiologice Lipsa raspunsului la tratament cu un antibiotic cu spectru larg (DAR NU chinolone !!!) Cel putin o cultura este in lucru. La persoanele HIV+ evaluarea diagnostica trebuie facuta cat se poate de rapid

Preventia tuberculozei

Preventia tuberculozei Primara: izolarea si tratarea cazurilor de tuberculoza pulmonara activa Secundara (prevenirea dezvoltarii bolii tuberculoase): Depistarea si tratarea infectiei tuberculoase latente Vaccinarea BCG

Grupe de risc Persoane expuse surselor de infectie Imunodeprimati Contacti familiali Institutii medicale (pacienti, personal) Imunodeprimati Infectie HIV Silicoza, limfoame, diabet zaharat, transplant de organ, etc Marginalizati social (penitenciare, azile, fara locuinta, imigranti)

Infectia tuberculoasa latenta Depistare: testare tuberculinica (diagnostic dificil in tarile unde vaccinarea BCG este obligatorie)+ TIGRA Tratament (chimioprofilaxie): izoniazida 5 mg/kgcorp/zi (max. 300 mg) timp de 6 luni

Tratamentul infectiei tuberculoase latente = Chimioprofilaxia INDICATII Contacti familiali < 5 ani indiferent de rezultatul testarii tuberculinice Infectati HIV cu testare tuberculinica pozitiva (> 5 mm) Eventual alte categorii: Alti contacti familiali ai bolnavilor cu TBP/M+ (in special cu viraj tuberculinic si/sau < 35 ani) Alte categorii de imunodeprimati cu testare tuberculinica pozitiva

Riscurile HIN induce o toxicitate hepatica a carei frecventa creste cu varsta = risc foarte ridicat peste 30-35 ani Eficienta chimioprofilaxiei nu este 100% Riscul de inducere a unei rezistente este real Utila DOAR DACA riscul de reinfectie este scazut

Vaccinarea BCG Vaccin viu atenuat (bacilul Calmette-Guerin provenit din M. bovis) Efect: Protectie partiala (20-60%) impotriva dezvoltarii tuberculozei boala Prevenirea formelor grave de tuberculoza la copil (TB diseminata, meningita TB)

Indicaţiile vaccinării BCG Toţi nou născuţii şi sugarii până în 12 luni de viaţă şi revaccinarea celor care nu prezintă în decurs de 6 luni o cicatrice post-vaccinală mai mare de 3 mm; EXCEPŢIE: nou născuţi cu mame pozitive pentru BAAR în spută: la aceştia se realizează chimioprofilaxia (sau terapia antituberculoasă) Sugari şi copii cu IDR negativ la tuberculină care se află la risc crescut de expunere apropiată şi prelungită la adulţi cu tuberculoză pulmonară netratată sau ineficient tratată şi nu pot fi îndepărtaţi de la sursa de infectie Copiii născuţi din mame HIV pozitive, deja infectaţi HIV, necesită vaccinare BCG imediat după naştere

Contraindicaţiile vaccinării BCG 1. IDR pozitiv; 2. SIDA; 3. Boli febrile, convalescenţă după boli infecţioase; 4. 6 luni după hepatita virală; 5. TBC activă; 6. Afecţiuni dermatologice acute; 7. Greutate < 2500 g. la naştere; 8. Imunodeficienţe congenitale; 9. Leucemii, limfoame, boli maligne.

Evolutie postvaccinala Evolutie normala: induratie rosie (3-4 saptamani), uneori cu ulcerare, in final cicatrice usor retractila cu diametru de 5 mm Complicatii locale: adenopatii satelite uneori fistulizate, ulceratie locala prelungita Complicatie generala: BCG-ita (= infectie diseminata, similara tuberculozei diseminate, ce apare la imunodeprimati)