Biofizikalne osnove svjetlosne i elektronske mikrokopije 2014 Prof. dr. sc. Dario Faj

Mikroskop

Mikroskopija Osnovna zadaća – stvaranje slike s povećanom rezolucijom (razlučivanjem) Razlučivanje – mogućnost razlikovanja detalja Snaga razlučivanja (RP) – najmanja udaljenost dva detalja u objektu koji se mogu razlikovati

Rezolucija oka Vidni kut zatvaraju svjetlosne zrake koje s krajeva predmeta dolaze u oko i stvaraju sliku Razlučivanje određeno vidnim kutom Može se izračunati RP ≈ 50 µm na DJV Sferne i kromatične aberacije smanjuju snagu rezolucije ≈ 100 µm na DJV

Optički instrumenti - Lupa Povećavamo vidni kut promatranja

Optički instrumenti - mikroskop objektiv daje realnu uvećanu sliku i određuje rezoluciju mikroskopa okular djeluje kao lupa i stvara virtualnu sliku na 25 cm od oka kutno povećanje mikroskopa

Ograničenje razlučenja – pinhole camera Udaljavamo film => beskonačno veliko razlučivanje???? Problem 1: velika rupa Problem 2: svjetlost ima valna svojstva

Svjetlost – EM val Promjena brzine u sredstvu => promjena smjera Fokusirane svjetlosne zrake ne čine točku:

Valna svojstva – ogib (difrakcija)

Valna svojstva – interferencija

Interferencija Jednak put: Konstruktivna λ/2 razlika puta: Destruktivna

Mikroskop: valna optika Raspodjela svjetlosti u Ravnini slike: TOČKA? NE. Point spread function:

Slika točke u lateralnoj ravnini PSF ima središnji disk (Airy). Prvi tamni disk ima polumjer: r=0.61 λ/NA Normalna Uvećana

Numerička apertura Otvorni kut objektiva tvore zrake koje još sudjeluju u stvaranju slike (idu rubovima leće) Veći otvorni kut objektiva: sferni valovi udaljeniji => bolje razlučivanje

Efekt numeričke aperture na sliku (PSF) Valovi koji još uvijek čine sliku su udaljeniji za veliki NA, rezultat je uža središnja slika objekta.

Uporaba imerzijskog sredstva imerzijsko sredstvo između objektiva i preparata smanjuje otklon zraka svjetlosti iz preparata pa povećava rezoluciju

Numerička apertura

Slika točke u lateralnoj ravnini PSF ima središnji disk (Airy). Prvi tamni disk ima polumjer: r=0.61 λ/NA Normalna Uvećana Uz, NA=1.4 i λ=480nm => r=225 nm RAYLEIGHOV KRITERIJ: RP=r

Kada možemo reći da se radi o dva objekta? (Rayleigh kriterij)

Nema razlike u povećanju samo NA Korisno povećanje=rezolucija oka na 25 cm/rezolucija mikroskopa= 100µm/200nm=500

Ograničenje rezolucije, supermikroskopija vs konvenc Ograničenje rezolucije, supermikroskopija vs konvenc. epifluorosc (z os prikazana bojom)

Koja struktura nas zanima?

Posebni optički mikroskopi – povećanje kontrasta kvaliteta slike ovisi o rezoluciji i kontrastu (razlikovanje na temelju različitosti intenziteta propuštene svjetlosti) biološki preparati su disperzni sistemi u vodi – kontrast je vrlo slab poboljšanje: 1. bojenje dijelova preparata (amplitudni preparat) 2. razlika optičkih putova uzrokuje razliku faza (fazni preparat) – pretvara se u razliku intenziteta 3. uzrokovani fazni pomak ogibnih snopova - različite osvjetljenosti preparata i pozadine 4. primjena fluorescencije (prirodne i izazvane) - konfokalni mikroskop

Interferencijski mikroskop broj valova na putu L je različit u otapalu i preparatu: razlika faza izlaznih valova tu razliku faza pretvaramo u razliku intenziteta - interferencija valova koji prolaze kroz preparat i onih koji prolaze oko njega not 1 1 l0 l npr 2 2 l’ L

Primjer: Detalj s većim indeksom loma od okoline Oko ne vidi razliku u fazi.

Izvedba interferencijskog mikroskopa snop koji ne prolazi kroz preparat snop kroz preparat

jajašca i spermiji morske alge snimljeni interferencijskim mikroskopom

Fazno-kontrastni mikroskop konični snop zraka ogiba se na preparatu i na leći fazna pločica u stražnjoj žarišnoj ravnini objektiva pomiče razliku faza 0-tog i ostalih ogibnih maksimuma s l/4 na l/2 zbog destruktivne interferencije slika preparata je tamna strukture unutar preparata zbog dodatne razlike faza dobro se uočavaju fazni prsten ogibni maksm. objektiv uzorak kondenzor

Mikroorganizmi snimljeni fazno- kontrastnim mikroskopom bakterije protozoe

Usporedba kontrasta za ‘klasični’ i fazno kontrastni mikroskop

Mikroskopi koji koriste fluoroscenciju Jedna od najbrže rastućih metoda Koriste svjetlost proizvedenu u uzorku Vrlo osjetljivi (50 fluoroscentnih molekula po mikronu) Puno out-of-fokus svijetlosti Jablonski dijagram fluoros

GFP (green fluorescent protein) se vezuje na receptore za glukagon Jezgre bubrežnih stanica embrija - plava boja se vezala na DNA endosomi (crveno), GFP-receptor (zeleno) nakon tretmana bubrežnih stanica, receptor iz membrane migrira u citoplazmu hepatokarcinoma stanice snimila Lada Krilov

Konfokalni fluorescentni mikroskop (pretraživački; laserski snop) laserski snop se fokusira na malo područje uzorak je fluorescentan reflektirana i fluorescentna svjetlost se razdvajaju zrcalom apertura ispred detektora propušta fluorescentnu svjetlost samo iz dijela uzorka u ravnini žarišta objektiva mogućnost rekonstrukcije 3D slike

Optički put u konfokalnom pretraživačkom fluoroscentnom mikroskopu

Detektor (fotomultiplikator) Mora biti brz (konfokalni snop nekoliko µs za pixel)

‘Konvencionalni – konfokalni’ Zamagljena slika jer mikroskop ‘vidi’ svjetlost koja dolazi iz ravnine fokusa, ali i onu koja ne dolazi iz te ravnine Blokira svjetlost koja ne dolazi iz ravnine fokusa – omogućuje 3D rekonstrukciju

bubrežne stanice embrija tretirane glukagonom (glukagonski receptor fluorescira zeleno) snimila Lada Krilov

Nedostatci konfokalnog mikroskopa Loša efikasnost prikupljanja svijetla (fotomultiplikator je brz, ali prikupi oko 25% fotona i pretvori u elektron) Spor – snima točku po točku (1µs za točku - 1Mpixel? ≈ 1s) Teško je snimati funkcionalnost ako se nešto događa brzo RJEŠENJE: Koristiti više apertura i detektora

Spinning disc confocal Koristi puno apertura odjednom => toliko je brz da se može koristiti CCD kao detektor

Kada koristiti konfokalni mikroskop? Fiksirani uzorci: Tanki uzorci – ‘konvencionalni mikroskop’ Uzorci debljine do 100 µm – konfokalni Preko 100 µm, previše out-of-fokus svjetlosti => specijalizirani mikroskopi (npr. dvofotonski) Živi uzorci Dodatno voditi računa o preživljenju uzorka tijekom obasjavanja laserom

Elektronski mikroskop Rayleighov kriterij – glavno ograničenje svjetlosne mikroskopije r=0.61 λ/NA Jedino rješenje smanjiti valnu duljinu => x-zrake? De Brogli, valna svojstva elektrona (λ=h/mv) ubrzanih u električnom polju: Ek=(mv2)/2 = e U

Elektronski mikroskop Heisenbergova relacija neodređenosti?

Specimen interaction is what makes Electron Microscopy possible. The energetic electrons in the microscope strike the sample and various reactions can occur as shown below. The reactions noted on the top side of the diagram are utilized when examining thick or bulk specimens (SEM) while the reactions on the bottom side are those examined in thin or foil specimens (TEM).

Izvedba TEM mikroskopa Snop iz katode Ubrzanje do cca 100 kV Vakuum Leće – magnetska polja koja usmjeravaju elektrone U stvaranju slike sudjeluju elektroni raspršeni na atomima Raspršenje na težim atomima veće (bolji kontrast) – biološki materijali imaju mali kontrast Priprema preparata: zamrznut, reže se na tanke slojeve ( do 100 nm) da ne dođe do apsorpcije elektrona, bojanje teškim atoma radi boljeg kontrasta, radi osiguranja mehaničke stabilnosti preparat se smješta na nosač (srebrna mrežica) top magnetske leće uzorak elektroni slika vakuum kamera

Nosač preparata

TEM – presjek stanice

Tanki uzorak alge obojan teškim metalima (Ur, Pb)

Tanki nanokristal silicija EM Stanica pod EM Tanki nanokristal silicija EM Biološki materijal: vakuum, loš kontrast, osjetljiv na zračenje

Može i brzo zamrzavanje (uzorak hidratiziran)

Prikupljanje i analiza TEM slika Samo 2D slike Za biološke uzorke malo elektrona na površini Usrednjavanje niza slika iste projekcije 3D (CT)

Pretraživački elektronski mikroskop - SEM lošija rezolucija,dmin= 5-10 nm, usporediva s dimenzijom upadnog elektronskog snopa 3D kvaliteta slike dobiva se upotrebom struje sekundarnih elektrona kojom moduliramo ‘osvjetljenost’ slike top leće plankton uzorak detektor pumpa

SEM

“Scanning tunneling” mikroskop (STM) Prikazuje se morfologija površine uzorka Izvor elektrona je mikrovršak pod naponom od nekoliko V Piramida wolframovih atoma Tunel efekt – struja tunelirajućih elektrona proporcionalna s udaljenošću vrška od površine uzorka. Konzola vrlo osjetljiva na pokret šiljka

“Scanning tunneling” mikroskop (STM) kad je proba vrlo blizu površine javlja se struja tuneliranja, It koja se detektira varijacijom položaja probe tako da se It održava konstantna, dobiva se reljef površine - vizualizacija pojedinačnih atoma potreban je vodljiv uzorak – ograničena biološka primjena na uzorke koji se mogu obložiti ugljikom ili platinom

“Atomic force” mikroskop (AFM) između vrha probe i uzorka djeluju privlačne Van der Waalsove sile koje primiču konzolu uzorku na velikoj blizini, odbojne sile savijaju konzolu unatrag registracija - preko reflektiranih laserskih snopova koji padaju na niz fotoćelija mjerenje sile vezivanja, na pr. ligand-receptor

SEM SEM TEM TEM Neuroni Stanične organele

Elektronski mikroskop Elektronski mikroskop popunjava prazninu od 1 µm (optički mikroskop) do 1 nm (rendgenska difrakcija)