Ērlihiozes un ērču encefalīta izsaucēju molekulārā bioloģija (Projekts LU13 , 2003.g.) Projekta vadītāji: Prof. V.Baumanis - LU Bioloģijas fakultāte Prof. A.Žilevica - LU Medicīnas fakultāte Izpildītāji: R.Ranka - PhD stud.biol. A.Bormane - PhD stud.biol. A.Zeltiņa - stud. pharm. L.Timša - stud. biol.bac. V.Šķipars - stud. biol.bac. K.Salmiņa - mag.biol. I. Zeltiņa - PhD stud.med. RSU Konsultanti: V.Sondore - Dr.med., Valsts Infektoloģijas centrs B. Rozentāle - Dr.med., Valsts Infektoloģijas centrs,RSU A.Dūks - Dr.med., Sabiedrības Veselības aģentūra

Saslimšanas gadījumu skaits ar ērču encefalītu Z-Eiropā un Krievijas ZR daļā Latvijā 2003.g. - 365 saslimšanas gadījumi, t.i., 15,66 gadījumi uz 100 000 iedzīvotāju

Pētījumu aktualitāte Saslimstība Latvijā Kur ir labāk Kur ir sliktāk (uz 100.000 iedzīvotājiem) Ērču encefalīts 12,8 0,01(Norv) 15,8 (Est) Erlichioze ? ? Zināms vienīgi,ka Zviedrijā ap 5% ērču inficētas Laima borelioze 11,5 3,1(Norv) 46,3 (Lt) Babezioze ? ? Vācijā 1,9% ērču inficēts Riketsiozes ? ? Vācijā ~ 9% ērču Wollbachias ? ? Vācijā ~ 1% ērču Koksiellozes ? ? ? (Q drudzis)

1. Izstrādāt minēto infekciju molekulārās detektēšanas Pētījumu mērķi 1. Izstrādāt minēto infekciju molekulārās detektēšanas metodes uz polimerāzes ķēdes reakcijas pamata,jo: a) ērču encefalīta vīrusu (TBEV), kā arī ērlihijas ir grūti kultivēt b) lai noteiktu ērču inficētības pakāpi , nepieciešmi salīdzinoši dati, kas iegūti ar dažādām metodēm 2. Veikt minēto infekciju molekulāro tipēšanu: a) epidemioloģiskiem pētījumiem b) mikroorganismu celmu dažādās patogenitātes analīzei, jo piemēram, ērču encefalīts (TBE) raksturojas ar ļoti dažādu klīnisko formu smagumu, kuru cēlons nav zināms c) mikroorganismu evolūcijas prognozēšanai d) terapijas un profilakses pasākumu izstrādāšanai - vai ir atbilstība starp Latvijā lietoto vakcīnu vīrusu genotipiem un ērču vīrusiem 3. Mēģināt raksturot virēmijas intensitāti un ilgumu , salīdzinot to ar TBE klīniskās formas smagumu

TBEV subtipu izplatība Eirāzijā Rietumu subtips- pārnēsā I.ricinus (dzeltens) - letalitāte 0,5 - 2 % Tālo Austrumu subtips- pārnēsā I.persulcatus (sarkans) - letalitāte 1 - 4 % sastopami abi subtipi (oranžs)

TBE diagnosticēšanas metodes Tiešās (vīrusa noteikšana) RT- PCR Elektronmikroskopija Vīrusu kultivēšana Netiešās (antivielu noteikšana) ELISA Immunoblotēšana Hemaglutinācijas inhibīcijas tests (HIT) Vīrusu neitralizācijas tests (NT) Komplementa fiksācijas reakcija (CFR)

TBEV struktūra Sastāv no trīs strukturālajiem proteīniem: E- apvalka glikoproteīns (imunogēnais) M- membrānas glikoproteīns C- kapsīdas proteīns

Ērču encefalīta vīrusa genoms un tā tipēšana Vienpavediena RNS , dažādiem celmiem 10.927-11.141 nukleotīdu gara, kodē 3 struktūras proteīnus: V1(M) - kopā ar E proteīnu piedalās apvalka veidošanā V2(C) - core proteīns V3(E) - apvalka proteīns, glikoproteīns, ar hemaglutinīna īpašībām, šis antigēns inducē neitralizējošo antivielu biosintēzi 7 nestrukturālie proteīni NS1, NS2A, NS3, NS4A, NS4B, NS5, tie sintezējas kā poliproteīns, kurš vēlāk sašķeļas, funkcijas nezināmas Detektēšanai izmanto: 5’- terminālā gala nekodējošā rajona 128 nukleotīdu garu fragmentu Detektēšanai un tipēšanai izmanto: NS5 proteīna kodējošā rajona 252 nukleotīdu garu fragmentu

Darba shēma Ērču materiāla savākšana Klīniskā materiāla izvēle TBE vīrusa RNS izolēšana (fenola - hloroforma metode vai QIAamp® Viral Mini Kit) Ērlihiju nukleīnskābes izolēšana - fenola - hloroforma metode Ērlihiju DNS fragmentu PCR amplifikācija TBEV cDNS sintēze (reversā transkripcija) Rezultātu analīze 2,5% agarozes gēlā vai 8% PAAG Atsevišķu amplikonu skvenēšana

Metodes jūtības noteikšana TBEV 5'NCR rajona RT-PCR amplifikācijas produktu elektroforētiska analīze 8% PAAG gēlā 1. celiņš - DNS garuma marķieris 2., 3., 4., 5., 6., 7., 8., 9. celiņi - ērču encefalīta K23 celma antigēna (Encepur vakcīna) atšķaidījumi, solis - 10x 6. celiņš - robežatšķaidījums, 9,8 fg TBE vīrusa RNS 10. celiņš - negatīvā kontrole 184bp 124bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Sekvenēšanas rezultāti pierādīja amplikonu specifiskumu

TBE vīrusa nekodējošā rajona (5’NCR) fragmenta RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction) metodes jūtība tika noteikta 9,8 fg TBE vīrusa RNS • TBE vīrusa NS5 gēna fragmenta RT-PCR metode uzrādīja zemāku jūtību - apmēram 900 fg TBE vīrusa RNS

TBE vīrusa detektēšana ērcēs I TBEV 5'NCR rajona RT-PCR amplifikācijas produktu elektroforētiska analīze 2,5% agarozes gēlā. 3., 4. celiņš- Encepur vakcīna (172 bp) 5.celiņš- Krievijā ražota TBE vakcīna 2.celiņš- negatīvā kontrole 1.celiņš- DNS garuma marķieris 1 2 3 4 5 267bp 184bp 1., 5., 7., 8.celiņš- PCR produkti no neinficētām ērcēm 2., 3., 4., 6.celiņš- PCR produkti no inficētām ērcēm 11.celiņš - DNS garuma marķieris, 10.celiņš- pozitīvā kontrole 9.celiņš- negatīvā kontrole 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 267bp 234bp 213 192 184

TBE vīrusa detektēšana ērcēs II TBEV NS5 gēna fragmentu RT-PCR amplifikācijas produktu elektroforētiska analīze 8% PAAG gēlā. 1.celiņš- pozitīvā kontrole (252 bp) 2.celiņš- DNS garuma marķieris 3.celiņš- negatīvā kontrole 5.celiņš- PCR produkts no inficētām ērcēm 6., 7.celiņš- PCR produkti no neinficētām ērcēm. 1 2 3 4 5 6 7 267bp 234bp

TBEV detektēšana ērcēs III Tika analizēti 12 ērču grupu (60 ērces, pa 5 vienā grupā) un 22 individuālu ērču paraugi, RNS izolēšanai izmantoja fenola-hloroforma metodi no 22 individuālajām ērcēm, kas bija piesūkušās cilvēkiem, 17 iepriekš bija noteiktas TBEV pozitīvas ar ELISA metodi, ar 5’NCR fragmenta RT-PCR metodi pozitīvu rezultātu deva 1 paraugs (glabāti paraugu lizāti) ar 5’NCR fragmenta RT-PCR metodi TBEV pozitīvas bija 7 no 12 dabā savākto ērču grupām (11%) ar NS5 gēna fragmenta RT-PCR metodi TBEV pozitīvas bija 3 no 12 dabā savākto ērču grupām (5%)

Sabiedrības veselības aģentūras dati (2003.g. - 6,7%) (2003.g. ~ 18%)

TBEV detektēšana asins plazmas paraugos • Ar TBEV 5’NCR fragmenta RT-PCR metodi tika analizēti 13 TBE slimnieku asins plazmas paraugi, vīrusa RNS izolēšanai tika izmantots QiAamp Viral Mini-kits • Paraugi bija ņemti no dažādiem slimniekiem, un visos paraugos iepriekš ar ELISA metodi bija apstiprināta specifisko antivielu pret TBEV klātbūtne, antivielu titrs paraugiem bija dažāds • Ar TBEV 5’NCR fragmenta RT-PCR metodi visi 13 asins plazmas paraugi uzrādīja negatīvu rezultātu

Erlihiju taksonomisko raksturojumu mēģina precizēt pēc 16S rRNS secības

Ērlihiju detektēšanai izmantotais 16S rRNS gēna fragments

Polimerāzes ķēdes reakcijas dati rāda, ka ērlihijas Latvijas ērcēs ir

Secinājumi RT-PCR metode ir perspektīva TBE vīrusa detektēšanai ērču materiālā, nākotnē šī metode varētu sniegt iespēju diferencēt dažādos TBE vīrusa subtipus Izvēlētās RT-PCR metodes jūtība ir pietiekoši liela, taču tās pielietošanu ierobežo neskaidrā virēmijas aina TBE slimniekiem un RNS nestabilitāte Pirmoreiz Latvijā ar molekulāram metodēm pierādīta ērču inficētība ar ērlihijām

Neatrisinātie jautājumi Vai virēmija TBE gadījumos ir vai nav novērojama un ja ir, tad: a) kurā slimības stadijā to novēro b) vai virēmijai ir kāda saistība ar antivielu titru c) vai vīruss nesorbējas uz eritrocītiem Kādu sugu ērcēs , to attīstības stadijās biežāk novērojama to inficētība ar TBEV un ērliijām Kāda genotipu TBEV un ērlihiju variabilitāte sastopama Latvijā Vai ir kāda sakarība starp TBEV genotipu un TBE klīniskās formas smagumu Vai cilvēki Latvijā ar ērlihiozēm neslimo, vai tās vienkārši netiek atklātas Kuri gēnu produkti ir mikroorganismu patogenitātes faktori un kuri gēnu produkti izraisa neitralizējošo antivielu vai šūnu imunitātes atbildi Makroorganisma nozīme minēto infekciju gaitā Kā evolucionē mikroorganismu ģenētiskie tipi

Publikācijas, disertāciju darbi un uzstāšanās par projekta rezultātiem 1. R.Ranka, A.Zeltiņa , A.Bormane, I.Zeltiņa.Ērču encefalīta vīrusa detektēšana ar molekulārās bioloģijas metodēm - Latvijas Universitātes 62. Zinātniskā konference , 2004.g. 2. Bormane A., Lucenko I., Duks A., Mavchoutko V., Ranka R., Salmina K., Baumanis V. Vectors of tick-borne diseases and epidemiological situation in Latvia in 1993-2002. International Journal of Medical Microbiology. 2003, v.293, 36-47. 3. R.Ranka. Ērču izraisīto infekciju - laima slimības un encefalīta molekulārā diagnostika. Disertācija aizstāvēta 2004.g.2.jūnijā 4. A.Bormane. Ixodes ērču un to pārnēsāto patogēnu pētījumi. Pašreiz norit eksperimentālā materiāla vākšana disertācijai (aizstāvēšana tiek plānota uz 2005-6.g.) 5. Bormane A., Ranka R., Salmina K., Lucenko I . Natural foci of tick-borne diseases and epidemiological situation in Latvia during the last decade. VII International Simposium on Tick-borne diseases, Berlin, 2003 6. R.Ranka, A.Bormane, V.Baumanis. Molecular studies on tick-born disease causing agents in Latvia. Abstracts of 29th FEBS Congress. Warsaw, Poland, June 26-30,2004 (accepted).

Saskarsme ar citiem pētniecības projektiem LZP projekts 02.0924 - Latvijā sastopamo Borrellia sugu un Borrelia burgdorferi tipu molekulāri ģenētiska izpēte Iesniegts projekts EC 6. Satvaram : EDEN - Tick-born diseases. Koordinators S.E.Randolf , Oxford University, UK. Kā līdzdalībnieki ir 13 valstis Iesniegts projekts EC 6. Satvaram: PatoGenoMics. Koordinators W.Diekmann (Vācija) Kā līdzdalībnieki 8 valstis