اصول انجام و تضمین کیفیت آزمایشهای غربالگری تالاسمی ازمایشگاههای نجف اباد
دستورالعمل جمع آوری نمونه خون وریدی رعایت اصول ایمنی استفاده از سرنگ خلاء استفاده از دستکش برای نمونه گیر ظروف سیفتی باکس رعایت اصول احتیاطات استاندارد
هنگام نمونه گیری نباید غذا ومایعات یا آدامس در دهان خود داشته باشد مطابقت درخواست آزمایش با مشخصات مراجعه کننده ثبت مشخصات بر روی ظرف CBC وضعیت مطلوب حین نمونه گیری صندلی مناسب هنگام نمونه گیری نباید غذا ومایعات یا آدامس در دهان خود داشته باشد از نواحی سوخته التیام یافته خونگیری نشود از مناطقی که دچار هماتوم است نمونه گیری نشود
از الکل 70 جهت ضدعفونی و از مرکز به محیط انجام شود. موضع ضد عفونی شده در معرض هوا خشک شود. به آرامی پونکسیون انجام شود. خون به آرامی داخل ویال CBC تخلیه شود. پس از خونگیری بلافاصله 10 بار سرو ته شود یا روی میکسر قرار گیرد. در صورت خونریزی موضع بیش از 5 دقیقه باید موضع را بانداژ نمائید.
راههای جلوگیری از هماتوم راههای جلوگیری از همولیز قبل از خارج ساختن سوزن حتما بازوبند باز شود از وریدهای سطحی اصلی خونگیری شود بعد از خونگیری موضع را کمی فشار دهید راههای جلوگیری از همولیز الکل موجود در موضع با جریان هوا خشک شود از نیدل با سایز باریک استفاده نشود از محل هماتوم نمونه گیری نشود نیدل به سرنگ کاملا متصل باشد پیستون به آرامی عقب کشیده شود مخلوط نمودن نمونه به آرامی صورت گیرد
ویژگیهای یک ماده ضد انعقاد خوب عدم تغییر در اندازه گلبولهای قرمز عدم همولیز جلوگیری از تجمع پلاکتی بر روی کیفیت رنگ آمیزی غیر موثر باشد کمترین اثر را بر روی مورفولوژی گلبولها داشته باشد دوام نمونه نسبتا زیاد باشد
EDTA انواع K2 + دو مولکول آب (پودر کریستال) حلالیت بیشتر+ کارایی برای کالیبراسیون K3 به (شکل مایع) ایجاد چروکیدگی + کاهش 1%HB + کاهش 2% HCT Na2 + دو مولکول آب (پودر کریستال) حلالیت کمتر پایداری نمونه: 4-6ساعت در دمای اتاق
نسبت ضد انعقاد به خون غلظت بالا غلظت پایین به ازای هر میلی لیترخونK2EDTA(mg) 0.25 ± 1.5 1.2 K3EDTA(mg)” “ “ “ “ “ غلظت بالا چروکیدگی گلبولهای سفید + تورم و فروپاشی پلاکت ها روی HBبی تاثیر است چروکیدگی گلبولهای قرمز خطا در اندکس ها غلظت پایین ایجاد لخته و میکرو لخته و تاثیر روی پلاکت ها K2EDTA را 6% ساخته و 50λ آن را به 2سی سی خون اضافه نمایید
مدارک وسوابق موجود در آزمایشگاه غربالگری تالاسمی 1-مشخصات مسئول انجام آزمایش 2-شناسنامه سل کانتر 3-روش کار با سل کانتر 4-شناسنامه اسپکتروفتومتر 5-روش کار با اسپکتروفتومتر 6-مشخصات کیت HBA2 وروش کار با آن 7- مستندات کالیبراسیون دستگاه سل کانتر 8- مستندات کالیبراسیون اسپکتروفتومتر
اصول کار با دستگاههای شمارشگر بر اساس امپدانس الکتریکی فلوسیتومتری، ترکیب قوانین اپتیک و فیزیک مایعات و استفاده از واکنش های سیتوشیمی
طرز کار دستگاههای شمارشگر امپدانس دو محفظه برای شمارش وجود دارد محفظه شمارش RBC، PLT محفظه شمارش WBC کووت اندازه گیری هموگلوبین به روش فتومتری
پس از رقیق شدن خون، محلول لیزینگ RBCها را لیز می کند. HB تبدیل به سیانومت هموگلوبین به روش فتومتری اندازه گیری می شود. غشاء WBCها سوراخ دار شده روی هسته چروکیده می شود. با عبور هر سلول از روزنه یک مقاومت الکتریکی ایجاد می شود. بر اساس حجم سلول دامنه این مقاومت تغییر می کند. شمارش در واحد زمان ارزیابی می شود. IMPLUS UNIT TIME CV روش دستگاهی پایین تر از روش دستی است.
Constant Current Source Impedance Principle Constant current Insulated chambers Vacuum pump Isotonic electrolytes More on next slide Container Aperture Tube with Aperture Cell 9% NaCl Electrolyte Vacuum Pump Constant Current Source Electrodes Direction of Flow
Impedance Principle (Cont’d) Aperture size is 50-100µm “Aperture size: 80 µm for commercial unit” Measure changes in electrical resistance Change in impedance is proportional to individual volume Accurately counts and sizes cells
منابع خطا در دستگاههای شمارشگر عبور همزمان چندین سلول از روزنه ( Coincidence error) تاثیر یک نمونه بر نمونه دیگر (Carry- over) WBC بیش از 50,000 (MCV، RBC بيشتر از حد معمول) RBCها به شکل سیگاری شکل از روزنه عبور می کنند در روش فلوسیتومتری گلوتارالدئید RBCها را فیکسه میکند ایجاد ولتاژ بیش از حد سلولها در کنار روزنه (درصورتيكه سلول درست از وسط روزنه عبور كند ولتا‍ِژي متناسب با حجم خود توليد مي كند.) نقش سیستم جاروبگر وحذف اثر گردابی
خطاهای مربوط به اندازه گیری هموگلوبین تاخیر تبدیل کربوکسی به سیانومت هموگلوبین کدورت محلول درابکین افزایش WBCبیش از 50000 افزایش لیپید و پروتئین لیز نشدن RBC ها
خطاهای شمارش گلبولهای سفید حضورnRBCها مقاومت RBCها در محلول لیزینگ گلبولهای تارگت در بیماریهای کبدی گلبولهای قرمز جنینی هموگلوبینوپاتیها به شکل هتروزیگوت یا هموزیگوت آگلوتینینهای سرد با عیاربالا(کلامپ RBCها) تشکیل ذرات در خون و شمارش آنها بجای WBCها
منابع خطا در شمارش گلبولهای قرمز افزایش کاذب وجود ژیانت پلاکتها لکوسیتوز بیش 50000 ذرات تجمعی کاهش کاذب همولیز میکروسیتوز شدید یا RBCهای شکسته اثر آنتی کرهای سرد
خطاها در شمارش پلاکت افزایش کاذب کاهش کاذب ذرات غیر طبیعی گلبولهای قرمز شکسته یا میکروسیتوز شدید کاهش کاذب وجود میکرو لخته پدیده اقماری
MCVمنابع خطا در اندازه گیری هیپوکروم شدید و سیگاری شدن زیاد مانده شدن خون آگلوتینین های سرد پدیده تورم حاد میکروسیتوز بسیار شدید یا گلبولهای شکسته عدم رعایت نسبت خون و ضد انعقاد
لنفوسیت ها Mon,Bas,Eos<<نوتروفیل ها اساس شمارش افتراقی لنفو سیت ها 35-90 FL نوترو فیل ها 150-450 FL لنفوسیت ها Mon,Bas,Eos<<نوتروفیل ها ” <>160 90 ”
Image of the aperture film under microscope Drilled by laser and measured under electronic microscope ~60um
اساس کار دستگاههای فلوسیتومتری Inlet Outlet Darkfield stop disk Light Source Beam Aperture Photodiode
کنترل کیفی آماری تاریخچه جنگ جهانی دوم و واحدهای تولیدی خدماتی اثبات کارایی این روش پس از تجارب بدست آمده در این دوره آزمایشگاه یک واحد تولیدی خدماتی است
تاریخچه کنترل کیفی آماری در آزمایشگاه در سال 1924آقای شوهارت اصول نمودارهای کنترلی را در آزمایشگاه بالینی مطرح کرد 7سال بعد مقاله((کنترل اقتصادی کیفیت محصولات تولید شده)) در آزمایشگاههای بالینی را ارائه داد در سال 1950 لوی و جنینگ نمودارهای کنترل کیفی آماری در آزمایشگاههای بالینی را طراحی کردند در سال 1980 اقای وستگارد الگوهای برنامه ریزی کنترل کیفیت فرایند آماری را مدلسازی کرد سمبروفسکی نیز در زمینه cu.sumوکنترلهای همبسته نمودارهای ارزشمندی را تشریح کرد
کالیبراسیون و کنترل کیفی روشهای کالیبراسیون قبل از کالیبراسیون از صحت قسمتها اطمینان حاصل کنید نتایج cv دستگاه قابل قبول باشد 10-20نمونه راسه بار به روش دستی و دستگاهی اندازه گیری کنید میانگین روش دستگاهی-میانگین روش دستی 100× =CF میانگین روش دستگاهی
روش کالیبراسیون در دستگاه سیسمکس میانگین روش دستی CF(SYSMEX)= × فاکتور کالیبره قبلی میانگین روش دستگاهی
کنترل کیفی کنترل کیفی داخلی تصدیق کالیبراسیون کنترل کیفی خارجی کنترل کیفی داخلی تصدیق کالیبراسیون کنترل کیفی خارجی انواع خطاها خطاهای راندوم خطاهای سیستماتیک دقت (PERCISION) صحت(ACCURACY)
حداقل نمونه برای محاسبات آماری 20مورد تعیین محدوده اطمینان استفاده از نمونه های کنترل تجارتی اندازه گیری MEAN formula: SD = Σ ( x – x )2 n – 1 اندازه گیری انحراف از معیار SD رسم نمودار با تعیین محدوده 1SD,2SD,3SD
Normal Distribution Mean
قوانین وستگارد One control value outside the mean±2SD WARNING One control value outside the mean±3S REJECT: SE or RE 2consecutive controls exceed mean±2SD REJECT: SE 4consecutive controls exceed mean+1SD or-1SD REJECT: SE 6consecutive controls on one side of the mean WARNING:SE
12S Rule = A warning to trigger careful inspection of the control data +3SD +2SD 12S rule violation +1SD Mean -1SD -2SD -3SD Day
13S Rule = Reject the run when a single control measurement exceeds the +3SD or -3SD control limit 13S rule violation Mean -1SD -2SD -3SD Day
Westgard Rules: 10X Antibody Units Assay Run +3 sd +2 sd +1 sd Target value -1 sd -2 sd -3 sd Assay Run VZV IgG ELISA: Target Value = 49 U/ml
TREND SHIFT
CUMMULATIVE SUM (CU SUM) مجموع تفاوتهای روزانه به منظور ارزیابی روی این نمودار ثبت می شود خطاهای راندوم یکدیگر را حذف کرده وخطاهای سیستمیک به وضوح مشاهده می شود بهتر از لوی جنینگ خطاهای سیستماتیک راشناسایی می کند توصیه میشود هر دو روش همزمان درآزمایشگاه بکار گرفته شود
T Brittin آزمون آماری در صورت فقدان خون کنترل این روش بسیار موثر است 8پارامترCBCبمدت 24ساعت در دمای 4درجه ثابت می ماند تعداد 5 یا 10 نمونه با مقادیر طبیعی جدا شود روز بعد پس از به دما رسیدن و روتاتور شدن به دستگاه داده شود اگر مقدار عدد بحرانی برای 5 نمونه کمتر از 2/78 باشد با اطمینان 95% اختلاف معنی داری بین نتایج وجود ندارد در غیر این صورت اشکال احتمالی برای پارامتر مورد نظر وجود دارد که در صورت تداوم باید اقدامات لازم انجام شود
DUPLICATE TEST روش استفاده از نمودار حداقل 20نمونه را تکرار و میانگین قدر مطلق اختلافها را محاسبه و در عدد 2/45 ضرب میکنیم محدوده بالای اطمینان بدست می آید از هر 20تست یکی را تکرار میکنیم استفاده از فرمول قدر مطلق اختلاف دو خوانده نباید از ±2SD بیشتر باشد خطاهای تصادفی را نشان میدهد از هر 20خوانده فقط یکی مجاز است که خارج از محدوده باشد
MOVING AVERAGE آزمون BULL میانگین اندکسها را در بیش از500 بیمار بدست آورید میانگین هر دسته 20تایی روزانه نباید از 3% میانگین بالاتر یا پایین تر باشد. اگر از 3% بالاتر بود باید 3دسته 20تایی چک شود. این آزمون نسبت به شمارش RBC حساسیت ویژه دارد. وجود خطا نشانگر عدم صحت عملکرد و تغییر کالیبراسیون است.
CORRELATION CHECK مقایسه نتایج یک فرد با توجه به تغییرات طبیعی نباید بیش از مقادیر زیر باشد HB 2g/d MCV 6fl MCH 5 pg HCT 5%
REPLICATE TEST هر ماه یکبار یک نمونه را 10 بار به دستگاه داده وcv را بدست می آوریم نباید با ادعای شرکت سازنده مغایرت داشته باشد WBC 3% PLT 4% OTHER <1.5%
کنترل کیفی خارجی نمونه خون کنترل مشخص از آزمایشگاه رفرانس به آزمایشگاههای محیطی ارسال می شود از نتایج ارسالی MEAN ، SD و نمودار تهیه می شود MEAN - جواب آزمایشگاه = (DI)اندکس میانگین SD
<0.5 عالی 0.5-1 رضایت بخش 1-2 قابل قبول (بینابینی) 2-3 نیاز به بررسی آزمایش و کالیبراسیون >3 اقدام فوری