عنوان آزمايشگاه: اسپكتروفتومتري هدف آزمايشگاه: آشنايي بااجزاي دستگاه اسپكتروفتومتري وقوانين اسپكتروفتومتري اسپکتروفتومتر ناحیه مریی Spectrophotometer
اسپكتروفتومتر اسپكتروفتومتر يا طيف سنج يك دستگاه آزمايشگاهي اوليه است كه جهت خواندن نتايج آزمايش‌هايي كه واكنش آنها از نوع End point هستند به كار مي‌رود. اين دستگاه ميزان جذب يا عبور طول موج‌هاي مشخصي از انرژي تابشي (نور) از يك محلول را اندازه گيري مي‌كند بيشترين كاربرد آن در آزمايشگاه، در بخش بيوشيمي است.اساس كار اسپكتروفتومتر همانند بسياري از دستگاه‌هاي آزمايشگاهي، بر اندازه گيري ميزان نور جذب شده توسط يك محلول رنگي است كه طبق قانون بير-لامبرت ميزان جذب نور (OD) متناسب با غلظت ماده حل شده در محلول است.
روشهای طیف سنجی براساس بر هم کنش تابش الکترومغناطیسی با ماده بنیان گذاری شده است و چون امواج الکترومغناطیس، حاصل کاهش سرعت ذرات با بار الکتریکی است بنابراین توسط ماده جذب شده و سبب افزایش سرعت ذرات می گردد. علاوه بر این انرژی نورانی در بر هم کنش با ماده و جذب آن توسط ماده، باعث برانگیختن ماده به ترازهای انرژی بالاتر می گردد. بنابراین بسته به شدت و قدرت انرژی وارده به ذره با ماده بر هم کنش کرده و پدیده خاصی را سبب می گردد که اساس اندازه گیریهایی نظیر اسپکتروفتومتری را تشکیل می دهد.
كووت كــووت‌هــا مـحـفـظــه‌هــاي شـفــافــي هـستنـد كـه مـحـلـول مـورد آزمـايـش در آن ريـخـتـه شـده و در جايگاه خاص خود كه در مسير نور تكرنگ تعبيه شده است قرار مي‌گيرد. كووت‌ها با توجه به نوع مصرف، جنس، شكل و حجم متفاوتي دارند. براي مـحـلــول‌هــاي اسـيــدي و قـلـيــايـي از كـووت‌هـاي مـخـصوص شيشه‌اي و براي طول موج‌هاي زير 320 نـانـومـتـر از لـولـه كوارتز يا پلاستيك استفاده مي‌شود.
كاليبراسيون كاليبراسيون اسپكتروفتومتر، فرايندي است كه در آن مراحلي جهت تضمين صحت كار دستگاه به‌كار گرفته مي‌شود. اين روش تضمين مي‌كند كه اندازه گيري‌هاي به دست آمده توسط وسيله مورد نـظــر دقـيــق هـسـتـنــد. روش كــالـيـبــراسـيــون بــراي مدل‌هاي مختلف متفاوت است با اين حال اكثر تـولـيـدكـنـنـدگـان كـتـابـچـه راهـنـمـايـي را كـه شـامل جزئيات كاليبراسيون و نحوه كار با دستگاه است، براي استفاده كاربران فراهم مي كنند. اسپكتروفتومتر قادر است تا به عنوان فرستنده و گـيــرنــده نــور عـمـل كنـد. ايـن وسيلـه بـراي آنـاليـز نمونه‌هايي از ماده تست، توسط عبور نور از درون نمونه و خواندن شدت طول موج‌ها مورد استفاده قــرار مــي‌گـيــرد. نـمــونــه‌هــاي مـخـتـلـف نـور را بـه روش‌هـاي مختلـف فشـرده مـي‌كننـد و بـه محقق اجازه مي‌دهند تا توسط بررسي رفتار نور هنگام عبور از نمونه مورد نظر، با ساختار آن بيشتر آشنا شوند. در كاليبراسيون اين وسيله، از يك محلول مرجع جهت تنظيم صفر دستگاه استفاده مي‌شود.
در اسپكتروفتومتر تك پرتويي، يك پرتو نور توليد و دستگاه بايد بعد از هر بار استفاده، كاليبره شود. در نــوع دو پــرتـويـي، پـرتـوهـا از طـريـق نمـونـه تسـت فرستاده مي‌شوند و نمونه مرجع در همان زمان، دو مجموعه از نتايج را كه مي‌تواند به عنوان مرجع و كـــالــيـبــراسـيــون اسـتـفــاده شــود، تــولـيــد مــي‌كـنــد. كـالـيبراسيون مي‌تواند در آزمايشگاه توسط افراد باتجربه نيز صورت گيرد. البته اگر دستگاه دچار آسيب يا مشكل جدي شود، بايد جهت تعمير و تنظيمات اوليه به كارخانه سازنده يا نمايندگي‌هاي معتبر ارجاع داده شود.
1-دستگاه را روشن كنيد و 10 دقيقه منتظر بمانيد تا دستگاه گرم و آماده به كار شود. 2-نور محفظه را تغيير دهيد تا به طول موج مورد نظر برسيد. 3-كووت را تا نيمه با محلول واكنش پر كنيد. كووت نبايد حاوي نمونه ناشناخته باشد. 4-دو طرف كووت را با دستمال پاك كنيد. 5-آن را در مـحـفـظــه قــرار دهـيـد و درب آن را ببنديد. 6-منتظر بمانيد تا اندازه گيري تمام شود.
نحوه كار با اسپكتروفتومتر D 20/20 1-دستگاه را روشن كنيد. اجازه دهيد تا به مدت 15 دقيقه گرم شود. 2-طول موج مورد نظر را با دكمه قرار گرفته در كنار محفظه نمونه تنظيم كنيد. 3-محفظه نمونه را بررسي كنيد تا از خالي بودن آن مطمئن شويد. دكمه مربوط به تنظيم صفر را كه در جـلـو و سـمـت چـپ اسـپـكـتـروفـتـومـتـر اسـت، بچرخانيد تا مقدار صفر را نمايش دهد. 4- براي اطمينان از پاكيزگي و كاهش اشتباه در نتايج اندازه گيري، از دستكش استفاده كنيد. 5- كووت را با آب مقطر پر كنيد و آن را در نگـه دارنـده قـرار دهيد. كووت را به سمت پايين فشار دهيد تا در جاي خود تراز شود. دقت كنيد كه خارج كووت تميز و خشك باشد. 6-دكمه كنترل نور را كه در جلو و سمت راست دستگـاه قـرار دارد، بچـرخانيد تا مقدار عبوري يا جذب را بخواند. 7-سپس كووت نمونه را در محفظه قرار دهيد. مقدار نشان داده شده را ثبت كنيد.
اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه اسپکتروفتومتر 1- منبع نورانیLight Source 2- عدسی ها: 3- شکافها (slits) 4- منوکروماتور(monochromators) 5- محل نمونه: 6- دتکتور (نور سنج 7- رکوردر (الکتریک سنج)
اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه اسپکتروسکوپ اسپکتروفتومتر از دو بخش اسپکترومتر و فتومتر تشکیل شده است. اسپکترومتر بخشی است که نور منوکروم را ایجاد کرده و دارای منبع نور، عدسی، شکافها، منوکروماتور (صافی، منشور یا ((Grating system) می باشد. بخش فتومتر دارای اسباب سنجش نور می باشد. 1- منبع نورانی: منبع نور مورد استفاده در اسپکتروفتومتر بسته به ناحیه مورد استفاده، متفاوت می باشد. برای نورهای مرئی از لامپ تنگستن استفاده می شود که نورهایی با طول موج بین 350 تا 800 نانومتر ایجاد می کند. و برای نورهای ماوراء بنفش (UV) از لامپ جیوه، هیدروژن استفاده می شود. این لامپها در ناحیه بین 200 تا 600 نانومتر بکار می روند. در دستگاههای پیشرفته تر هر دو نوع لامپ وجود دارد.
2- عدسی ها: (آینه ها): برای کنترل کردن مسیر نور، وجود عدسی لازم است 2- عدسی ها: (آینه ها): برای کنترل کردن مسیر نور، وجود عدسی لازم است. به جای عدسی ها از آینه هایی که به شکل نیمدایره یا محدب ساخته شده اند می توان استفاده نمود. 3- شکافها (slits): در هر اسپکتروفتومتری دو شکاف وجود دارد: یکی را شکاف ورودی و دیگری را خروجی می گویند. شکافها رل مهمی در جداکردن نور دلخواه با طول موج مشخص دارند. به همین جهت اندازه این شکافها بسیار مهم هستند. بیشتر دستگاهها پیچی دارند که اندازه این شکافها را می توان برحسب احتیاج تغییر داد. هر چه طول این شکافها بیشتر باشد پهنای نور عبوری (band-pass) بیشتر بوده و دامنه طول موج آن نیز زیاد می باشد و به عبارت دیگر نورهای دیگری که مورد نیاز نیستند عبور می کنند. این نور اضافی را Stray light می نامند
4- منوکروماتور(monochromators): اشعه نورانی پس از عبور از عدسی ها و شکاف مقدار و مسیر آنها کنترل شده سپس به دستگاهی که می تواند نور پلی کروم را به منوکروم تبدیل کند وارد می شود. پس نوری با طول موج مشخص و انتخابی به وجود می آورند. دو نوع منوکروماتور وجود دارد منشور و Grating. 5- محل نمونه: ظرف محتوی نمونه را سل یا کووت (cuvett) می نامند که از جنس شیشه، کوارتز یا پلاستیک است. برای اندازه گیری شدت رنگ محلولها و بلانک بکار می رود. سلهای شیشه ای و پلاستیکی برای ناحیه مرئی به کار می رود و در ناحیه ماوراء بنفش از سل کوارتز استفاده می شود. طول سلها معمولا 1 سانتی متر است و سلهایی با طول cm 1/0 تا cm 10 نیز موجود می باشد. محل قرار گرفتن نمونه بسته به اینکه دستگاه جایگاه جدا برای رفرنس (بلانک) دارد یا نه، Single beam و Double beam نام دارد.
6- دتکتور (نور سنج): نور پس از عبور از عدسیها و شکافها و منوکروماتور به محلول لوله آزمایش رسیده و از آنجا به نورسنج می رود. اسباب منوکروماتور، نور دلخواه و با طول موج مشخص را به لوله آزمایش می تاباند. رنگ این نور مکمل رنگ محلول است. اگر رنگ محلول سبز- آبی (مثل تعیین مقدار گلوکز بوسیله ارتو تولوییدین) به طول موج nm 495-475 باشد رنگ فیلتر- منشور یا گریتینگ باید نارنجی یا نزدیک آن با طول موج بین nm 620-600 باشد. چون رنگهای نارنجی مکملش سبز-آبی است. بنابراین وقتی منوکروماتور رنگ مکمل رنگ محلول را به لوله آزمایش می تاباند مقداری از آن به وسیله محلولی که در لوله وجود داشته و بستگی به غلظت مواد مورد آزمایش دارد ،جذب شده و بقیه آن به نورسنج می رسد.
نورسنج با تبدیل انرژی نورانی به انرژی الکتریکی قادر است که مقدار جذب این نور را به وسیله محلول و یا درصد ترانس – میتانس آن اندازه گیری نماید. دتکتورها شامل انواع فتوشیمیائی، فتوالکتریکی و حرارتی می باشد که در ناحیه مرئی و ماوراء بنفش از دتکتورهای فتوالکتریکی مانند فتوولتتیک و فتوتیوب و فتومولتی پلایر تیوب استفاده می شود.
7- رکوردر (الکتریک سنج) در اسپکتروفتومتر احتیاج به دستگاهی است که جریان الکتریکی دتکتور را اندازه بگیرد. دو سیستم گالوانومتر و نول پوینت وجود دارد که در اسپکتروفتومترهایی که دارای نواحی مرئی باشند معمولا از یک گالوانومتر یا صفحه دیجیتالی استفاده می شود. دیاگرام زیر، طرح یک اسپکتروفتومتر ساده را نشان می دهد.
اسپکتروفتومتر نشر شعله (Flame): ساختمان این دستگاه شبیه اسپکتروفتومتر یا فتومتر ساده است با این تفاوت که در فتومتر، لامپ الکتریکی و در این دستگاه نور حاصل از سوختن ماده مورد آزمایش در درون شعله به عنوان منبع نوری در نظر گرفته می‌شود. در طیف سنجی نشر شعله، نور حاصل مستقیما اندازه‌گیری می‌شود. اسپکتروفتومتر جذب اتمی (Atomic Absorption): اسپکتروفتومترهای جذب اتمی (AAS) غلظت عناصر فلزی که از نظر پزشکی برای حفظ سلامتی مهم است را اندازه گیری می‌کند. در خصوص این عناصر می‌توان به کلسیم، منیزیم، مس، روی و آهن اشاره نمود. اسپکتروفتومترهای جذب اتمی همچنین برای تعیین اینکه آیا سطح درمانی داروهایی نظیر لیتیم در خون، تامین شده است یا خیر و همچنین برای آشکارسازی و تعیین کمیت سموم فلزی مورد استفاده قرار می‌گیرد
قانون کمی جذب یا قانون بیر-لامبرت: این قانون اساس تجزیه کمی در جذب سنجی را تشکیل می دهد.هرگاه یک نور تکفام با شدت I عمد بر سطح تابش دارد که یک محلول همگن و شفاف به ضخامت L و غلظت مولکولی C گردد،قسمتی از آن جذب می شود ( Ia) ،بخشی منعکس ( Ir) ، و قسمت دیگر از محلول عبور می کند و در امتداد شعاع تابش خارج می گردد ( It) بنابراین رابطه ی زیر برقرار است": It + Ia+Ir= Io
XC X 100 جذب نور X= جذب نمونه استاندارد 2-LOG T% =جذب A روش محاسبه XC X 100 جذب نور X= جذب نمونه استاندارد 2-LOG T% =جذب A