Hagnýting EPR litrófsgreininga í RNA rannsóknum

Slides:



Advertisements
Similar presentations
Áhrif námsefnis á kennsluhætti Námsgagnastofnun IS /
Advertisements

Amínoglýkósíð Katrín Þóra Jóhannesdóttir. Hvað eru amínóglýkósíð (AG) Bacteriocidal sýklalyf Streptomycin uppgötvað 1943 Eru unnin úr: ◦ Micromonospora.
Áhugasamir nemendur – Árangursríkt skólastarf Þróunarverkefni í Heiðarskóla 2010.
Stefnur í kennslufræðum Háskóli Íslands - Kennaradeild KEN201F-H10 Inngangur að kennslufræði (Vorið 2011)
Málþing um kennaramenntun á tímamótum Hvert verður hlutverk kennarans og hvernig getur hann best sinnt því? Jón Torfi Jónasson, prófessor í uppeldis- og.
The Goal kaflar The Goal. 21.kafli Hópurinn á fundi ásamt yfirmönum flöskuhálsavélanna Útbúinn er listi af seinkuðum verkum, raðað eftir seinleika.
Allskonar kynjasamþætting Halldóra Gunnarsdóttir Mannréttindaskrifstofu Reykjavíkurborgar.
Vorfundur Skólapúlsins maí 2011 Salur Námsmatsstofnunar Almar M. Halldórsson Kristján K. Stefánsson.
Tungumálið Spilling tungumáls (Caleb Thompson og Ibsen) Framsetning fræðitexta.
Áfengi og fíkniefni Kolbeinn. Kynning Í þessu verkefni munum við aðallega fjalla um áfengi, fíkniefni og hættu þess að neyta of mikils af því. Aðallega.
©2001 Þórdís Hrefna Ólafsdótttir
Petra María Gunnarsdóttir.. Danska hljómsveitin Mew var stofnuð í Hellerup Danmörku árið Hún var stofnuð af 4 strákum sem heita ; Jonas Bjerre,
Að kenna upplestur Baldur Sigurðsson, KHÍ nóvember 2008 Raddir, samtök um vandaðan upplestur og framsögn.
Fyrirlestur um fyrirlestra fyrir starfsfólk Greiningar og ráðgjafarstöðvar Fyrirlestur sem kennsluaðferð! Hvað má læra af rannsóknum á góðum kennurum?
Fervikagreining (ANOVA) ANOVA = ANalysis Of Variance “Greining á heildarbreytileika í safni athugana eftir breytileikavöldum” One-way ANOVA er notað til.
Líkamstjáning mannsins Þróun mannsins Kolbrún Franklín.
Mynd 1 sýnir fjölda einstaklinga eftir aldri í þeim 283 málum sem skráð voru hjá Sjónarhóli frá janúar 2010 – desember 2010.
Jacques-Louis David, Dauði Sókratesar, 1787
Ágúst 2006 © Þóra Björk Jónsdóttir 2 Ég fékk C fyrir víravirkið mitt !? Má ég koma með spurningu? Hvernig getur maður fengið C fyrir víravirki? Er það.
Bjarki Þorvaldur Sigurbjartsson 1 Áhrif metóprólóls á dánartíðni, sjúkrahúsinnlagnir og líðan sjúklinga með hjartabilun Effects of Controlled-Release Metoprolol.
Berglind Eyjólfsdóttir, rannsóknarlögreglumaður. Hvernig eru fórnalömb mansals? Staðalímynd Hvernig sjáum við fyrir okkur fórnalamb mansals? Hver er raunin.
Beinþynning Magnús Jóhannsson prófessor Tannlæknanemar 2013.
Slembin reiknirit Greining reiknirita 7. febrúar 2002.
Second-line treatment in advanced colon cancer: are multiple phase II trials informative enough to guide clinical practice? Bjarki Þorvaldur Sigurbjartsson.
Jónína Vala Kristinsdóttir KHÍ1 Að fá að treysta á eigin hugsun og glíma við krefjandi verkefni í skólanum.
Heilsufarsskoðanir fótboltaiðkenda KSÍ þing 2010.
Kynjuð fjárhags- og starfsáætlunargerð Reykjavíkurborgar Kynning 22. nóvember 2011.
Opinn hugbúnaður í skólastarfi og kennaranámi Salvör Gissurardóttir 8. Október 2005 Málþing KHÍ.
Mál og vald. Við skilgreinum okkur sumpart út frá málnotkun okkar. Hvernig erum við? Hvernig klæðum við okkur, hvaða tónlist hlustum við á, hvert förum.
Lífeyrissjóður bankamanna Helstu atriði breytingartillagna Framhalds ársfundur 20. september 2007.
Basophilar Föstudagsfundur Barnadeildar 17.nóvember 2006 Ingi Hrafn Guðmundsson Föstudagsfundur Barnadeildar 17.nóvember 2006 Ingi Hrafn Guðmundsson.
Jo Boaler Sérhæfir sig í stærðfræðimenntun og menntun kennara. Menntun
Rými Reglulegir margflötungar
Mismunandi bylgjuhreyfingar: þverbylgja, langsbylgja, yfirborðsbylgja
V = V0 [1+ β (T-T0 ) – k(p-p0 )] Ástandsjafna, fast efni:
Lehninger Principles of Biochemistry
Photochemistry Ljósefnafræði, hefur áhuga á efnafræðilegum áhrifum ljóss Efni örvað með ljóseindum (e.photons) úr grunnástandi í örvað ástand Efni aförvast.
Fátækt barna í velferðarríkjum
Ritstuldarvarnir með Turnitin
PET-rannsóknir Harpa Viðarsdóttir
MS fyrirlestur í Næringarfræði
Það er firra að allir íslenskir grunnskólar séu eins
FYLGJUMST MEÐ ! MSN spjallið Um hvað eru krakkarnir að spjalla ?
Íslensk gerð efnis er að fyrirmynd bandarískra gagna.
Effects of Ramipril on Coronary Events in High-Risk Persons
Kafli 11 í Chase … Ákvarðanir um afkastagetu
Fákeppni og einkasölusamkeppni
Almannatengsl Til hvers?
Case studies Óvenjuleg EKG
með Turnitin gegnum Moodle
 (skilgreining þrýstings)
FYLGJUMST MEÐ ! MSN spjallið Um hvað eru krakkarnir að spjalla ?
Metapneumovirus - greiningaraðferðir
Mæði-visnuveira og HIV: Margt er líkt með skyldum.
Þuríður Hjálmtýsdóttir Fjölskylduráðgjafi/sálfræðingur
Hypothesis Testing Kenningapróf
KÆL 102 Á heimasíðu danfoss
Leikur að lifa  Leikur að lifa 1 Hvernig ætli það væri að heita ekki neitt? Leikur að lifa.
Notkun ASEBA skimunarlista á Barnaverndarstofu
Vökvameðferð barna Jón Hilmar Friðriksson Barnaspítala Hringsins.
Nonparametric Statistics Tölfræði sem ekki byggir á mati stika
Vandinn við lestur – hverju er sleppt og hverju er haldið?
Nonparametric Statistics Tölfræði sem ekki byggir á mati stika
Ýsa í Norðursjó.
ENSÍM OG ENSÍMHVÖTT EFNAHVÖRF
Goodness-of-Fit Tests and Contingency Tables
Mælingar Aðferðafræði III
Torfbæir í Netheimum Þjóðháttavefur kennaranema
31/07/2019.
Hulda Þórey Gísladóttir
Presentation transcript:

Hagnýting EPR litrófsgreininga í RNA rannsóknum Höfundur fyrirlestrar: Egill Skúlason 19. febrúar 2003 Háskóli Íslands Raunvísindadeild Efnafræðiskor Eðlisefnafræði 5

Helstu heimildir Í fræðilegri útlistun á EPR litrófsgreiningu notast ég bæði við bækur Atkins og Banwell en nýti mér einnig hina margrómuðu og verðlaunuðu heimasíðu Ágústar Kvarans. Edwards, T.E., Okongi, T.M., Robinson, B.H., Sigurðsson, S.T. (2001). Site-Specific Incorporation of Nitroxide Spin-Labels into Internal Sites of the TAR RNA; Structure-Dependent Dynamics of RNA by EPR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. Vol 123, 1527-1528. Edwards, T.E., Okonogi, T.M., Sigurðsson, S.T. (2002). Investigation of RNA-Protein and RNA-Metal Ion Interactions by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy: The HIV TAR-Tat Motif. Chemistry & Biology, Vol. 9, 699-706.

Innihald fyrirlestrar Undirstöðuatriði fræðanna á bak við EPR. Rannsóknir á RNA. Mikilvægi EPR í RNA rannsóknum. „Spunamerkingar“ á RNA. Viðfangsefni og aðferðir rannsóknanna sem greinarnar byggja á. Niðurstöður rannsóknanna.

EPR = ESR Flestar stöðugar sameindir haldast saman með tengjum þar sem rafeindaspunar eru paraðir. Undir þeim kringumstæðum er enginn „sýnilegur“ spuni, ekkert rafsegulvægi og því ekkert samspil á milli rafeindaspuna og segulsviðs. Hins vegar eru til atóm og sameindir sem hafa eina eða fleiri rafeindir með óparaðan spuna og það eru þau tilfelli sem sýna rafspunamerki (Electron Spin Resonance eða ESR) í litrófsgreiningu. Þar sem þessi fyrirbæri eru einnig meðseglandi eða paramagnitísk, þá er þessi tegund litrófsgreiningar oft nefnd Electron Paramagnetic Resonance eða EPR.

EPR litrófsgreinir Algengast er að segulsviðið sé 0.3 T, sem þarf því 9 GHz eða 3 cm örbylgju til að merki fáist.

2S+1 = 2*½ + 1 = 2 eða ms = S, S-1,...,-S = +½ og -½ Fræði EPR Þegar óparaðar rafeindir eru til staðar í sameindum þá er spunastefna þeirra óregluleg. Þegar sameindunum er komið fyrir í segulsviði þá stefna þessir „litlu seglar“ (sem rafeindaspuni er í raun og veru) í ákveðnar áttir. Þar sem spunaskammtatala rafeinda er ½, þá er hægt að hugsa sér að hver þeirra snúist annað hvort réttsælis eða rangsælis um stefna segulsviðsins. Aðeins tvær afstöður: 2S+1 = 2*½ + 1 = 2 eða ms = S, S-1,...,-S = +½ og -½

Fræði EPR Eðlisfræði EPR litrófsgreiningar er í megin dráttum sú sama og í NMR. Orkuþrep rafeindaspuna í segulsviðinu B eru: Ems = gemBBms ms =  ½ þar sem mB er Bohr segulvægiseining og ge = 2,0023 Þessi jafna sýnir að orka a e- (ms = + ½) eykst en b e- (ms = - ½) minnkar þegar styrkur segulsviðsins er aukinn, og bilið á milli orkuþrepanna er DE = Eb – Ea = gemBB Ef sýnið örvast með rafsegulbylgju af tíðninni v, gildir: hv = gemBB

Orkuástönd rafeindaspuna í segulsviði

Útlit EPR rófa EPR róf eru í raun fyrsta afleiða eða hallatala af gleypni hvers punkts: dA/dB Útslag toppa ræðst af styrk radikala eða paramagnetísks efnis í sýninu. Breidd toppa ræðst af aförvunartíma spunaástandsins.

Hyperfine structure Orsök fyrir „hyperfine structure“ í EPR er víxlverkun á milli segla rafeindaspunans og segultvípólsvægis kjarnanna í radikalnum. Radíkal með einn 14N kjarna (I = 1) og tvær jafngildar prótónur (I = ½) gæfi eftirfarandi „hyperfine structure“.

RNA rannsóknir RNA (Ribonucleic acid) eru langar sykurfosfatskeðjur þar sem mismunandi niturbasar (A, U, G eða C) tengjast hverjum ríbósa. RNA getur hvatað efnahvörf og samverkað á sérstakan hátt með öðrum stórsameindum, eins og t.d. próteinum. Til að skilja hlutverk RNA þarf að ákvarða þrívíða byggingu þess. Að lesa út úr kristalsgreiningu flókinna RNA sameinda getur reynst mjög erfitt. Því hafa aðrar aðferðir verið notaðar til að ákvarða stöðu eininga í RNA secondary byggingu (helixa, lykkjur o.fl.) í þrívíðu rúmi. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) er hægt að nota til mæla langar fjarlægðir (35-85 Å).

Mikilvægi EPR í RNA rannsóknum Með því að „merkja“ ákveðna niturbasa í RNA sameindinni er hægt að rannsaka gang hvarfa, þrívíða byggingu og samspil RNA við t.d. prótein eða málmjónir með EPR. Mælingar hafa verið gerðar með 8-25 Å vegalengd á milli tveggja óparaðra rafeinda. „Merkingarnar“ eru framkvæmdar með ýmsum efnasmíðum þannig að „merkti“ hópurinn hafi staka rafeind. Þannig fæst aðeins eitt merki, sem getur jú verið margklofið, en þannig er hægt á einfaldan hátt að túlka einstakar niðurstöður ef merkt er á mismunandi stöðum í RNA sameindinni.

„Spuna merkingar“ á RNA Nitroxíð spunamerki hefur verið innleitt í DNA annað hvort á niturbasa eða sykurfosfatskeðjuna. Hins vegar eru einu aðferðirnar (2001) til að innleiða spunamerkið í RNA, á óparaðan uridine basa eða 5’-enda keðjunnar. Aðferðirnar eru takmarkaðar því spunamerkið er ekki hægt að festa innvortis í basaparað tvístrennt RNA. Margar sameindir hafa verið festar á 2´- kolefni hringsins í basapöruðum kjarnsýrum RNA. Hægt er að nota 2’-amínó breytt RNA, sem hægt er að útbúa með því að nota ýmis algeng fosfóramíð.

„Spuna merkingar“ á RNA Á þessari yfirlitsmynd er lýst hvernig festa má nitroxíð spunamerki á kolefni númer 2. Síðasta skrefið krefst DMF, formamide, borate buffer, pH 8.6, 90%

Tar RNA Tar RNA er svæði í erfðaefni HIV sem í samvinnu við Tat prótein sér um umritun í eftirmyndunarferli HIV veirunnar. TAR stendur fyrir Trans-Activation Responsive. Fjögur spunamerkt Tar RNA voru útbúin, hvert þeirra með eitt spunamerki í stöðum U23, U25, U38 og U40. U = Uridine

TAR RNA A) TAR RNA B) RNA sem vantar þriggja kirna lykkjuna sem er nauðsynleg fyrir Tat prótein bindingu.

Varmafræðilegar mælingar á RNA-unum Niðurstöðurnar sýna að spunamerkingarnar hafa ekki mikil áhrif á secondary byggingu RNA

EPR litróf af spunamerktum Tar RNA-um U38 og U40 eru svipuð róf og ættu að gefa góða mynd af öðrum EPR mælingum í „venjulega“ basapöruðu Tar RNA. Niðurstöðurnar sýna að það er takmörkuð hreyfing spunamerkisins, óháð kjarnsýrunni, sem er forsenda rannsókna í gangfræði.

EPR litróf af spunamerktum Tar RNA-um U23 og U25 rófin sýna greinilega meiri hreyfanleika (~ 40-falt) en U38 og U40. Í raun er hreyfanleiki U23 og U25 svipaður og hjá einstrendu RNA.

Samverkan RNA við prótein og málmjónir EPR litrófsgreining var notuð til að rannsaka breytingar í hreyfifræði spunamerktra kirna Tar RNA (U23, U25, U38 og U40) við bindingu á katjónum, argininamíði og tveimur peptíðum unnin úr Tat próteininu.

EPR litróf: TAR-Ca2+ og TAR-Na2+ tengi Svarta rófið er án málmjóna, blárauða með Ca2+ og það blágræna með Na+. EPR litrófsgreing sýnir breytingu í hreyfanleika U23, U25, U38 og U40 í viðurvist Ca2+ og Na+ jóna.

Tar-argininamíð tengi NMR greining á HIV-2 Tar RNA bundið við argininamíð hefur gefið vísbendingu um sérhæfða samverkan arginine 52 (R52) og Tar RNA í bindingu við Tat próteinið. Niðurstöður úr EPR: Lítil minnkun í hreyfanleika niturbasa U23 og U38. Hreyfanleiki U40 minnkaði mun meira en hreyfanleiki U25 jókst hins vegar.

Áhrif Tat afleiða á EPR litróf Tar RNA

Tar-Tat tengi EPR róf voru tekin af þeim fjórum áðurgreindu Tar RNA-um í viðurvist bæði stökkbreyts (YKKKKRKKKKA) og náttúrulegrar gerðar (YGRKKRRQRRR) Tat-afleiddu peptíðanna. Niðurstöður sýndu litla minnkun í hreyfanleika U23 og U38 en mun meiri minnkun hjá U40, í viðurvist stökkbreytta peptíðsins, á meðan hreyfanleiki U25 jókst. Rófin fyrir U25 og U40 með náttúrulega peptíðinu eru svipuð og hjá því stökkbreytta á meðan mjög mikil lækkun er hjá U23 og U38.

Áhrif Tat afleiða á EPR litróf Tar RNA

Magnbundin greining úr EPR

Magnbundin áhrif katjóna á Tar RNA úr EPR Ca2+ og Na+ hafa svipuð áhrif á Tar RNA. Hreyfanleiki U23, U25 og U38 minnkar á meðan U40 eykst. Argininamíð og stökkbreytt Tat (sem hefur a.s. R52) hafa svipuð áhrif á Tar RNA en hreyfanleiki U23 og U38 minnkar margfallt meira hjá náttúrulega peptíðinu en hjá því stökkbreytta. Þetta bendir til að fleiri amínósýrur en arginine 52 taki þátt í bindingu við Tar RNA-ið.

Niðurstöður dregnar saman Nitroxíð spunamerki er hægt að innleiða á ákveðna staði í RNA. Spunamerkingarnar hafa ekki áhrif á stöðugleika RNA. Umhverfi spunamerktu kirnanna hafa greinileg áhrif á EPR merkin. Ca2+ og Na+ hafa svipuð áhrif á hreifanleika kirnanna. Amínósýran arginine (R52) sem er bæði í argininamíði og stökkbreytta Tat peptíðinu spilar lykilhlutverk í tengingu við Tar RNA. Niðurstöður sýna að fleiri amínósýrur í náttúrulega peptíðinu hafa einnig áhrif á tengingu við Tar RNA.