فصل نهم : كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع فصل نهم : كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع هدف كلي : آشنائي با مباني نظري و عملي انواع كروماتوگرافي , دستگاهوري و كاربرد آنها درروشهاي كروماتوگرافي با روشهاي فيزيكي و به وسيله توزيع متفاوت بين دو فاز ساكن و متحرك دو يا چند تركيب در يك مخلوط از همديگر جدا ميشوند

انواع كروماتوگرافي بر اساس فاز ساكن و فاز متحرك فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع انواع كروماتوگرافي بر اساس فاز ساكن و فاز متحرك 1ـ كروماتوگرافي مايع Liquid Chromatography (LC) فاز متحرك مايع است 2ـ كروماتوگرافي گازي Gas Chromatography (GC) فاز متحرك گاز است 3ـ كروماتوگرافي گازـ جامد Gas-Solid Chromatography (GSC) فاز ساكن جامد است 4ـ كروماتوگرافي گازـ مايع Gas-Liquid Chromatography (GLC)

انواع ديگر كروماتوگرافي فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع انواع ديگر كروماتوگرافي 5- كروماتوگرافي با عملكرد بالا (HPLC) High Performance Liquid Chromatography 6- كروماتوگرافي مايع ـ مايع (LLC) Liquid-Liquid Chromatography 7- كروماتوگرافي كاغذي (PC) Paper Chromatography 8- كروماتوگرافي لايه نازك (TLC) Thin Layer Chromatography

اصول و مباني كروماتوگرافي مايع فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع جداسازي سه جزء اصلي

Injector Detector T=0 T=10’ T=20’ Flow of Mobile Phase فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع Flow of Mobile Phase Injector Detector T=0 T=10’ T=20’ Most Interaction with Stationary Phase Least

فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع

فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع هر جزء (x) ضمن حركت در ستون بين دو فاز ساكن Stationary Phase (S) و متحرك mobile Phase (m) تقسيم ميشود هر چه Kx بزرگتر باشد جزء x تمايل بيشتري به ماندن در فاز ساكن دارد و كندتر حركت مي كند و برعكس اگر Kx كوچك باشد جزء x بيشتر تمايل دارد در فاز متحرك باقي بماند و به همراه آن سريعتر حركت كند در نتيجه سريعتر از ستون خارج شده و اين پديده باعث جداسازي اجزاء مي شود Xm  Xs , Kx = [X]S / [X]m

كروماتوگرام مربوط به سه جزء فرضي فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع كروماتوگرام مربوط به سه جزء فرضي كروماتوگرام : رسم تغييرات غلظت بر حسب حجم فاز متحرك يا زمان خروج

فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع

حالت عمومي انتقال گونه روي فاز ساكن فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع

كروماتوگرافي جذبي (adsorption chromatography) فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع كروماتوگرافي جذبي (adsorption chromatography) كروماتوگرافي جذبي ياكروماتوگرافي مايع ـ جامد (LSC) بر اساس برهم كنش بين مولكولهاي حل شده و نقاط مناسب و فعال روي سطح فاز جامد بوجود مي آيد معمولاً نقاط فعال يوني هستند و تركيبات قطبي تر را بيشتر جذب ميكنند . مثل جداسازي الكلها و تركيبات هيدروكربني .

فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع كروماتوگرافي تقسيمي Partition Chromatography يا كرماتوگرافي مايع ـ مايع (LLC) مولكولهاي حل شده بر اساس قدرت انحلال نسبي بين دو مايع غير قابل اختلاط (emissible phases) كه فاز ساكن و متحرك را تشكيل ميدهند توزيع مي شوند .

كروماتوگرافي تعويض يوني ion exchange chromatography فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع كروماتوگرافي تعويض يوني ion exchange chromatography جدا سازي بر اساس يونهاي موجود در فاز متحرك و يونهاي جاذب مخالف در فاز جامد انجام ميشود

كروماتوگرافي طرد مولكولي Size-exclusion chromatography فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع كروماتوگرافي طرد مولكولي Size-exclusion chromatography بر اساس اندازه مولكولها جداسازي انجام ميشود فاز ساكن از نظر شيميايي بي اثر است . مولكولهاي كوچكتر در منافذ گير ميكنند و مولكولهاي بزرگتر سريعتر از ستون خارج ميشوند

موارد استفاده كروماتوگرافي مايع فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع موارد استفاده كروماتوگرافي مايع كروماتوگرافي مايع بيشتر براي جداسازي مواد آلي غير فرار مورد استفاده قرار ميگيرد . مانند تركيبات يوني ـ پليمرها و مواد بيولوژيكي . روشهاي مختلف كروماتوگرافي براي جدا كردن اجزاء مخلوط و بعد ارسال به يك دستگاه طيف سنج نيز كاربرد دارند . مثل GC-MS يا LC-IR ازاين روشها براي تجزيه كمي نيز استفاده ميشود

مباني تئوري كروماتوگرافي فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع مباني تئوري كروماتوگرافي هدف : جداسازي اجزاء يك مخلوط در زمان نسبتاً كوتاه K'x=درفاز ساكن x تعداد كل مولكولهاي / درفاز متحرك x تعداد كل مولكولهاي = (Vs/Vm)([x]s/[x]m) = (Vs/Vm)Kx حجم فاز متحرك = Vm حجم فاز ساكن = Vs فاكتور ظرفيت = K'x Vr = Vm(1+ K'x) = Vm+VsK'x حجم بازداري = Vr زمان بازداري = tr زمان عبور حلال خالص = to Vr = F tr Vm = F to F = (ml/min) سرعت حلال شوينده K'x = (tr-to)/to

فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع تمرين : فاكتور ظرفيت را براي پيكهاي B و C محاسبه كنيد . به ازاي سرعت جريان 2.0 ml/min حجم بازداري ومقدار K را براي پيك A محاسبه نمائيد. K'x = (tr-to)/to = (13-2)/2 = 5.5 K'c=(21.6-2)/2 = 9.8 K'A = (9.3-2)/2 = 3.6 Vm = F to = 2(2) = 4 ml Vr = Vm (1+ K'A) = 4(1+3.6) = 18.6 ml

مسافت طي شده توسط جزء مورد نظر فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع در كروماتوگرام TLC و PC بجاي حجم بازداري يا زمان بازداري از درجه بازداري Rf استفاده ميشود مسافت طي شده توسط حلال مسافت طي شده توسط جزء مورد نظر Rf =

فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع كارآيي ستون كارآيي ستون به سرعت پهن شدن نوار در موقع حركت ماده حل شده در ستون (عرض پيك كروماتوگرام) بستگي دارد و آن عبارت است از تعداد سطوح نظري در ستون (N) كه از كروماتوگرام بدست مي آيد N = 16 (tr/tw)2 H = L/N عرض پيك جزء مورد نظر بر حسب زمان = tr طول ستون = L ارتفاع سطوح فرضي = H جداسازي بهتر  كارآيي ستون بهتر  كوچكتر H  بزرگتر N

فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع تمرين : تعداد صفحات و سطوح نظري پيك C را محاسبه كنيد . اگر طول ستون 25cm باشد مقدار H براي پيك C چند ميليمتر است . اگر طول ستون دو برابر شود در صورت ثابت بودن بقيه پارامترها پهناي پيك C چه تغييري ميكند . N = 16(tr/tw)2 = 16(21.5/4.1) 2 = 440 H = L/N = 250/400 = 0.57mm N = 16(tr/tw)2  L/H = 16(tr/tw)2 ضريب تغيير tw 2 = 1.41 L ~ tw

عوامل پهن شدن پيكها (عوامل بزرگ شدنH): فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع عوامل پهن شدن پيكها (عوامل بزرگ شدنH): سرعت زياد فاز متحرك فضاها و حفره هاي خالي در لابلاي فاز ساكن حركتهاي گردابي و چرخشي فاز متحرك مجموع عوامل مؤثر روي H و در نتيجه پهن شدن پيكها : H = [1/(1/Hed) + (1/Hmp)] + Hld + Hsm + Hsp Hed = پخش گردابي , Hmp = انتقال جرم مربوط به فاز متحرك Hld = پخش و نفوذ طولی ماده حل شده Hsm = انتقال جرم مربوط به فاز متحرك بي حركت شده Hsp = انتقال جرم ماده حل شده به فاز ساكن

قدرت تفكيك در كروماتوگرافي (Resolution) فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع قدرت تفكيك در كروماتوگرافي (Resolution) R = (trB - trA)/(twA + twB) tr = زمان تأخير براي هر جزء tw = عرض پيك هر جزء R  0 پيكهاي قابل تشخيص نيست R ~ 1 حداقل جداسازي كمي R ~ 1.5 جداسازي كامل

عامل گزينندگي : (Selectivity factor) يا بازداري نسبي فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع عامل گزينندگي : (Selectivity factor) يا بازداري نسبي  = (trB - to)/(trA + to) = K'B / K'A هر چه مقدار  به يك نزديكتر باشد جداسازي مشكلتر است

اثر گزينندگي ، كارآيي و فاكتور ظرفيت بر قدرت تفكيك فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع اثر گزينندگي ، كارآيي و فاكتور ظرفيت بر قدرت تفكيك قدرت تفكيك ضعيف (A) قدرت تفكيك خوب كارآيي خوب ستون (B) قدرت تفكيك خوب گزينندگي خوب (C) قدرت تفكيك ضعيف فاكتور ظرفيت كم (D)

عوامل مؤثر بر قدرت تفكيك فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع عوامل مؤثر بر قدرت تفكيك R = ¼ N (-1 /) (K‘/1+K‘) فاکتور ظرفيت گزينندگی کارائی N  0 K‘ 0  R  0   1 قدرت تفكيك از بين ميرود اين سه عامل راميتوان طوري تنظيم كرد كه شرايط بهينه حاصل شود. تمام عوامل را بطور همزمان نميتوان در حد دلخواه بهبود بخشيد

ظرفيت ستون براي پذيرش نمونه فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع ظرفيت ستون براي پذيرش نمونه ظرفيت فاز ساكن براي پذيرش نمونه در كارهاي عملي عامل مهمي است كه بايد بهينه شود ارتباط عوامل در كروماتوگرافي

كروماتوگرافي كاغذي Paper Chromatography فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع كروماتوگرافي كاغذي Paper Chromatography ابعاد كاغذ 5x20 cm 20x20 cm قطر لكه حداكثر 2mm وزن نمونه 10-50g

انواع كروماتوگراقي كاغذي فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع انواع كروماتوگراقي كاغذي روش پائين رونده :B روش بالا رونده :A

فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع آشكارسازي در PC پس از جدا سازي و خشك شدن صفحه نركيبات جدا شده به روشهاي شيميايي يا فيزيكي شناسايي مي شوند براي تركيبات بي رتگ از سونهاي رنگي شناخته شده استفاده مي شود بعضي از تركيبات آلي غير اشباع داراي خاصيت فلوئورسانس هستند كه به وسيله يك لامپ UV به سادگي قابل تشخيص هستند براي بعضي تركيبات از يك ماده شاهد كه مشابه نمونه است استفاده مي شود مسافت طي شده توسط ماده استاندارد / x مسافت طي شده توسط تركيب مورد آزمايش = Rx

كروماتوگرافي لايه نازك (TLC) Thin Layer Chromatography فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع كروماتوگرافي لايه نازك (TLC) Thin Layer Chromatography سطح صفحاتي از جنس شيشه ، آلومينيوم ، پلاستيك با يك پودر جامد متخلخل متشكل از ذرات ريز به قطر5-40m پوشيده مي شود كه فاز ساكن را تشكيل مي دهد اين مواد شامل سليكاژل ، آلومين ، سلولز ، پلي اميد و رزينهاي تعويض يوني هستند ضخامت لايه بين0.2-0.3 mm براي كارهاي تجزيه و 2-10mm براي كارهاي كمي و تهيه اي

مقايسه TLC و PC براي جدا سازي مشابه )نوكلئوتيدها( فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع مقايسه TLC و PC براي جدا سازي مشابه )نوكلئوتيدها(

كروماتوگرافي ستوني مايع فصل نهم :كروماتوگرافي فاز جامد و فاز مايع كروماتوگرافي ستوني مايع كروماتوگرافي ستوني مايع معمولي كه مايع براساس نيروي سقل از بالا به پائين حركت مي كند . كروماتوگرافي مايع با عملكرد بالا (HPLC) يا كروماتوكرافي مايع با سرعت بالا (HSLC)در اين روش قدرت تفكيك و حساسيت زياد است و مي توان جدا سازي و اندازه گيري را همزمان انجام داد . در اين سيستم طول ستون زياد و عرض آن كم است . فاز متحرك با فشار بالا در ستون رانده مي شود ذرات فاز ساكن بسيار ريز و فشرده هستند و اين امر باعث ايجاد يك فشار معكوس مي شود

Gas Chromatography (GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم : Gas Chromatography (GC) كروماتوگرافي گازي هدف كلي : _ آشنايي با مباني نظري و عملي ، دستگاه هوري و كاربردهاي كمي و كيفي . _ در اين روش فاز متحرك بخار يا گاز است و فاز ساكن جامد يا مايعي است كه بر بستر جامد قرار گرفته است

اصول و مباني (GC) V'r = Vr - Vo t'r = tr - to Vr = tr Fc

J = 3/2 [(Pi/PO)2 – 1 / (Pi/PO)3 – 1] (GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم: در GC چون فاز متحرك گاز است و گاز نسبت به مايع تراكم پذير است مي بايست روي حجم تنظيم شده تصحيحي انجام شود تا حجم واقعي Vn به دست آيد Vn = J V’r J = 3/2 [(Pi/PO)2 – 1 / (Pi/PO)3 – 1] Pi = فشار ورودی PO= فشار خروجی J = ضريب تصحيح

دستگاهوري كروماتوگرافي گازي : (GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم: دستگاهوري كروماتوگرافي گازي :

(GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم:

(GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم:

(GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم: Injector Detector Column in Oven

ستونهاي كروماتوگرافي گازي : (GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم: ستونهاي كروماتوگرافي گازي : جنس ستون : آلومنيوم ، مس ، فولاد زنگ نزن و شيشه يا كوارتز . فاز ساكن : ذرات جامد بي اثر با اندازهاي مساوي ازجنس دياتومه دريايي . طول ستون : 25-100m و قطر داخلي0.3-0.6 mm ستونهاي کاپيلاری (موينيه) با حجم و قطر كمتر براي تجزيه مقادير كم به كار مي رود .

مواد پايه در ستونهاي كروماتوگرافي گازي (GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم: مواد پايه در ستونهاي كروماتوگرافي گازي اين مواد بايد پرمنفذ و سطح زيادي داشته باشند . معمولا خاك دياتومه دريايي كه از اسكلت جلبكهاي دريايي كه متشكل از سيليس آبدار بي شكل استفاده مي شود مايع فاز ساكن روي اين مواد اندود مي گردد و در مجموع فاز ساكن مايع را تشكيل مي دهد اگر اندود كامل نباشد بخشي از مواد پايه به صورت فاز جامد جاذب عمل مي كنند

(GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم: براي بهبود مرحله اندود قبل از اندود كردن عمليات شستشو با اسيد سيلان دار كردن و غيره انجام می شود.

(GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم:

خواص مواد پايه دياتومه اي (GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم: خواص مواد پايه دياتومه اي

مشخصات تعدادي از موادی كه بعنوان فاز ساكن به كار مي رود (GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم: مشخصات تعدادي از موادی كه بعنوان فاز ساكن به كار مي رود

(GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم:

تهيه ستون : (GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم: سه عامل مهم در تهيه ستونهاي كروماتوگرافي گازي بكار مي رود : 1- آغشته كردن ماده پايه به فاز ساكن مايع . 2- پر كردن ستون از اين ماده پركننده . 3- آماده سازي ستون قبل از نصب در كروماتوگرافي و استفاده از آن ستون مناسب ستوني است كه در زماني كوتاه ؛ بهترين نتايج از آن حاصل شود .

حجم نمونه درحد نانوليتر كه با سرنگهاي ميكروليتر تزريق مي شود (GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم: سيستم ورودي به ستون: سيستم ورودي مي بايست با دماي بالا باشد كه به محض ورود نمونه ، به بخار تبديل شود حجم نمونه درحد نانوليتر كه با سرنگهاي ميكروليتر تزريق مي شود انواع سيستمهاي ورودي : 1- سيستم ورودي يكجا تبخير كننده 2- سيستم ورودي شكافنده

سيستم ورودي يكجا تبخير كننده (GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم: سيستم ورودي يكجا تبخير كننده

سيستم ورودي شكافنده (GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم:

آشكارسازهاي معمولي در كروماتوگرافي (GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم: آشكارسازهاي معمولي در كروماتوگرافي آشكارساز هدايت گرمايی(TCD) Thermal Conductivity Detector آشكارساز يوني شدن دراثر شعله (FID) Flame Ionization Detector آشكارساز ربايش الكترون (ECD) Electron Capture Detector

(GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم: تجزيه كيفي شرايط مناسب براي ستون ـ مواد پركننده ـ فاز مايع ـ سرعت عبور گاز حاصل و برنامه دمائي براي جداسازيهاي خوب لازم است تأثير دما و برنامه دمايي بر كيفيت جداسازي شرايط همدما دماي برنامه ريزي شده

تجزيه كمي سطح زير پيك متناسب با غلظت تركيب مربوط به آن پيك است (GC) كروماتوگرافي گازي فصل دهم: سطح زير پيك متناسب با غلظت تركيب مربوط به آن پيك است منحني كاليبراسيون با مواد استاندارد بجاي تعيين سطح زير پيكها ضروري است تجزيه گازي خروجي از دودكشهاي صنعتي جهت اندازه گيري مواد سمي و سرطان زا اندازه گيري مواد مخدر و مواد بيولوژيكي در خون و ادرار اندازه گيري داروها ، بعضي از سموم و مواد غذايي