טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית

Slides:



Advertisements
Similar presentations
Recombinant DNA technology
Advertisements

Recombinant DNA Introduction to Recombinant DNA technology
טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית
Lecture ONE: Foundation Course Genetics Tools of Human Molecular Genetics I.
MCB 130L Lecture 1 1. How to get the most from your time in lab 2. Recombinant DNA 3. Tips on giving a Powerpoint talk.
Restriction Enzymes.
Molecular Genetics Introduction to The Structures of DNA and RNA
Concept 20.1: DNA cloning yields multiple copies of a gene or other DNA segment To work directly with specific genes, scientists prepare well-defined segments.
What causes LCA2 blindness?
TOPICS IN (NANO) BIOTECHNOLOGY Lecture 7 5th May, 2006 PhD Course.
Chapter 14. Genetic Engineering
Introduction to biotechnology Haixu Tang School of Informatics.
AP Biology: Chapter 14 DNA Technologies
-The methods section of the course covers chapters 21 and 22, not chapters 20 and 21 -Paper discussion on Tuesday - assignment due at the start of class.
歐亞書局 PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY Chapter 9 DNA-Based Information Technologies.
1 Genetics Faculty of Agriculture Instructor: Dr. Jihad Abdallah Topic 13:Recombinant DNA Technology.
Biotechnology AP Biology Chapter 20.
How do you identify and clone a gene of interest? Shotgun approach? Is there a better way?
 Isolate a specific gene of interest  Insert into a plasmid  Transfer to bacteria  Grow bacteria to get many copies  Express the protein product 
Recombinant Technololgy
Genetic Engineering. What is genetic engineering? Application of molecular genetics for practical purposes Used to – identify genes for specific traits.
Recombinant DNA Technology. Restriction endonucleases - Blunt ends and Sticky ends.
Recombinant DNA Technology (8)
DNA Technology. Overview DNA technology makes it possible to clone genes for basic research and commercial applications DNA technology is a powerful set.
19.1 Techniques of Molecular Genetics Have Revolutionized Biology
Fig Fig Fig Fig Fig
Concept 20.1: DNA cloning yields multiple copies of a gene or other DNA segment To work directly with specific genes, scientists prepare well-defined segments.
Chapter 20: DNA Technology and Genomics - Lots of different techniques - Many used in combination with each other - Uses information from every chapter.
Molecular Tools. Recombinant DNA Restriction enzymes Vectors Ligase and other enzymes.
Recombinant DNA Technology. DNA replication refers to the scientific process in which a specific sequence of DNA is replicated in vitro, to produce multiple.
Chapter 20 DNA Technology and Genomics. Biotechnology is the manipulation of organisms or their components to make useful products. Recombinant DNA is.
Green with envy?? Jelly fish “GFP” Transformed vertebrates.
Copyright © 2009 Pearson Education, Inc. Active Lecture Questions for Biology: Concepts & Connections, Sixth Edition Campbell, Reece, Taylor, Simon, and.
2 Chapter 9 Biotechnology & Recombinant DNA 3 Recombinant Technologies Terminology Recombinant DNA - artificially manipulated DNA Genetic Engineering.
Part 3 Gene Technology & Medicine
Figure 20.0 DNA sequencers DNA Technology.
Chapter 7 Recombinant DNA Technology and Genomics
DNA Technologies (Introduction)
Nucleic acid-based methods (I)
PLANT BIOTECHNOLOGY & GENETIC ENGINEERING (3 CREDIT HOURS)
Dr. Peter John M.Phil, PhD Assistant Professor Atta-ur-Rahman School of Applied Biosciences (ASAB) National University of Sciences & Technology (NUST)
Molecular Cloning: Polymerase Chain Reaction
Chapter 20: DNA Technology and Genomics
Figure 7.1 Polymerase chain reaction (PCR).
Dr T-J’s Minilecture Chapter 12.
DNA Tools & Biotechnology
Chapter 5 Exploring Genes and Genomes
Gene Isolation and Manipulation
Material for Quiz 5: Chapter 8
DNA Technology & Genomics
Transcription Translation Mutations rDNA Potpourri
Biotech Tools Review
Chapter 9: Biotechnology and Recombinant DNA
the manipulation of living organisms for human use Chapter 13
Chapter 20 – DNA Technology and Genomics
Chapter 12 DNA technology.
Polymerase Chain Reaction
Chapter 14 Bioinformatics—the study of a genome
Recombinant DNA Technology
Techniques for Analyzing DNA
DNA Tools & Biotechnology
Recombinant DNA Technology
Nucleic acid-based methods (I)
PBIO 427/527: Molecular Genetics Lecture 3 - Review
710.LC GRADUATE MOLECULAR BIOLOGY 10/31/2011
Recombinant DNA Unit 12 Lesson 2.
710.LC GRADUATE MOLECULAR BIOLOGY 9/15/2010
Polymerase Chain Reaction (PCR).
Chapter 20: DNA Technology and Genomics
Tools for Molecular Biology
Presentation transcript:

טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית 1. שיבוט cloning - : טכניקה לבידוד מקטע DNA 2. ריצוף DNA (sequencing) 3. PCR 4. microarray )ביו-ציפ (וריצוף עמוק. התרגיל להורדה: http://astlab.tau.ac.il/index.php/molecular-biology-course

אנזימי רסטריקציה

Cohesive = מתלכד 5’ overhang 3’ overhang

cloning

Polylinker or Multiple Cloning Site (MCS)

פלסמיד השיבוט

Plasmid cloning

האם ניתן לשבט מקטע דנא שנחתך בשתי הקצוות באינזים שחותך קצה ישר (blunt ends) לתוך פלסמיד שגם הוא נחתך עם אותו אינזים רסטריקציה? אי אפשר כי אין נקודת אחיזה אפשר כי מבחינה הסתברותית קצה ישר יגיע למגע עם קצה ישר שני

כמה אפשריות חיבור (אורינטציות) יש בין פלסמיד שנחתך באינזים רסטריקציה שיוצר קצוות ישרים (blunt) לבין רצף שני של DNA שנחתך באותו אינזים 1. אחד 2. שניים 3. שלוש 4. ארבע

טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית 1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים 2. שיבוט 3. ריצוף DNA (sequencing) 4. PCR (polymerase chain reaction) 5. microarray ביו-ציפ.

Taq polymerase Taq polymerase: is a thermostable DNA polymerase named after the thermophilic bacterium Thermus aquaticus from which it was originally isolated by Thomas D. Brock in 1965.

PCR – polymerase chain reaction 30 sec for 1Kb = elongation

PCR first PCR-2 In vitro mutagenesis / site-directed mutagenesis – מומלץ לצפייה Creating transgene mouse

The PCR product on the gel

Site-directed mutagenesis

עזרה בתרגיל F R תרגיל בשיבוט-2014 אורך פריימר לא פחות מ-18 בסיסים http:/astlab.tau.ac.il/index.php/molecular-biology-course עזרה בתרגיל F R תרגיל בשיבוט-2014 אורך פריימר לא פחות מ-18 בסיסים

טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית 1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים 2. שיבוט 3. ריצוף DNA (sequencing) 4. RCP 5. microarray ביו-ציפ.

מכשיר ריצוף DNA אוטומטי

ריצוף הגנום האנושי

גרג וונטר

454/Roche, Solexa/Illumina, ABI/Solid Deep-sequencing Noam Shomron / Tel Aviv University / The RNA World / January 2010 454/Roche, Solexa/Illumina, ABI/Solid

NEW OLD $3 billion 10 years 20,000 BACs 100kb > 2-3kb vectors Noam Shomron / Tel Aviv University / New Horizons in RNA processing / Nov-Dec 2009

טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית 1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים 2. שיבוט 3. ריצוף DNA (sequencing) 4. RCP 5. microarray ביו-ציפ.

Principle of Microarray (Chip) Assay Prehybridization Posthybridization Synthetic DNA probes Probes with hybridized DNA

microarray Genome microarray

כל נקודה מצינת גן מאוקטב. סוג הצבע ורמתו מיצגים את רמת הפעלת הגן

תוכנית ה-MD/PhD

ChIP-on-chip TF TF Antibody Binding sites Genomic Arrays We use a strategy known as ChIP-on-chip. As shown in this slide, a population of cells are treated with formadehyde to crosslink the DNA binding protein and their substrate in vivo. Then we sonicate the genome to break up the chromosome into small fragments, and use an antibody the specifically recognize the transcription factor to purify the complexes from the cell extract. This is known as ChIP, first invented by John Lis more than 2 decades ago. The second chip standards for microarrays, which are used to identify the enriched DNA sequneces. are then amplified, fluorescently labeled and identified through hybridization to a DNA microarray containing genomic sequneces for the orgnanism. The DNA microarray data is analyzed by statistics method and the target sites are can be simultaneously identified. Genomic Arrays

ChIP-seq in a nutshell

טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית 1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים 2. שיבוט 3. ריצוף DNA (sequencing) 4. PCR 5. microarray ביו-ציפ.

Gel electrophoresis ג'לים 1. ג'ל דנטורטיבי חלבונים – SDS 2. ג'ל דנטורטיבי DNA או RNA – אוראה או פורמאמיד 3. ג'ל נטיבי (מצבו הטיבעי של חלבון/DNA/RNA בתא) לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-RNA או DNA לא מוסיפים חומרים הגורמים לדנטורציה.

הפרדות על גבי ג'לים

Gel electrophoresis ג'לים 1. ג'ל דנטורטיבי חלבונים – SDS 2. ג'ל דנטורטיבי DNA או RNA – אוראה או פורמאמיד 3. ג'ל נטיבי (מצבו הטיבעי של חלבון/DNA/RNA בתא) לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-RNA או DNA לא מוסיפים חומרים הגורמים לדנטורציה.

Native gel

תרגיל בשיבוט – ד.נ.א רקומבינטיבי 1. הוטל עליך לשבט חלק מהרצף הגנומי של הגןsurvival of motor neuron 1 (SMN1) מאקסון 7 עד אקסון 9 (כולל). הרצף המופיע בתמונה הוא רצף pre-mRNA הנגזר מתוך הרצף הגנומי העומד לרשותך (האם ה-3’ UTR הוא חלק מאקסון 8?). 2. כמו כן לרשותך פלסמיד אשר לתוכו תשבט את הרצף הנדרש באתר ה- polylinker (תמונה 2). 3. במעבדה שלושה אינזימי חיתוך (רסטריקציה) ואתרי החיתוך שלהם מופיעים בתמונה מספר 3. 4. כמו כן במעבדה קיים האנזים RNA polymerase T7 בלבד שישמש אותך בהמשך המחקר בסנטזת ה-ר.נ.א של הגן המשובט. 5. כיצד תשבט את אקסון 7 עד 9 (כולל) של הגן SMN1 : פרט כל שלב ושלב (מהגברת מקטע הגן עצמו ועד שלב הפקת הפלסמיד), באיזה אנזימים תשתמש, רשום את רצף שני הפריימרים שתזמין, ומה יהיה עליך להזמין בנוסף על כך ? 6. מה יהיה עליך לעשות על מנת לקבל את ה pre-mRNA של הגן (אך ורק אותו!) ? הערה: ניתן לסנטז את ה pre-mRNA במבחנה (in-vitro), אז כיצד תסנטז את רצף ה-pre-mRNA מבלי לסנטז את רצף הפלסמיד שנמצא downstream לאקסון מספר 9? במעבדה ישנו מכשיר PCR, קיט תעשייתי להפקת פלסמיד (מאפשר להפיק פלסמיד מכמות גדולה של חיידקים) וכמו כן ניתן להזמין פריימרים (רצפי התחל). ראקציית ה- PCR מתבצעת ע"י ערבוב החומרים והכנסתם למכשיר ה- .PCR

תמונה 1: רצף גנומי חלקי של הגן survival of motor neuron 1 . (SMN1) Exon – red upper case Intron – black lower case Amino acids –under the center of the codon

תמונה 2: פלסמיד השיבוט polylinker

תמונה 3: אתרי חיתוך של שלושה אינזימי רסטריקציה Products generated by restriction enzymes Cohesive ends 5’ G AATTC 3’ 3’ CTTAA G 5’ EcoRI 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ BamHI 5’ GGATCC 3’ 3’ CCTAGG 5’ 5’ G GATCC 3’ 3’ CCTAG G 5’ XhoI 5’ CTCGAG 3’ 3’ GAGCTC 5” 5’ CTCGA G 3’ 3’ G AGCTC 5’