تعیین کمی میزان IgM , IgA ضد پلی ساکارید کپسولی پنوموکوک بروش New ELISA بعنوان یک وسیله تشخیصی و پروگنوستیک در بیماران CVID

شاه علامت CVID نقص در تولید مقادیر طبیعی آنتی بادی های ضروری برای پاسخ بر علیه طیف وسیعی از پاتوژن هاست که در ایجاد عفونت های شدید و ریکارنت این بیماران نقش دارد. کرایتریاهای تشخیصی CVID بر اساس PAGID/ESIDشامل موارد زیر است : (1) شروع IDبعد از 2 سالگی (2) میزان IgAوIgGسرم حداقل 2SD زیر حد متوسط برای سن (3) فقدان ایزوهماگلوتینین ها و یا پاسخ ضعیف به واکسن ها (4) رد کردن علل شناخته شده هیپوگاماگلوبولینمی

ریسک فاکتورهای ایجاد پنومونی های حاد باکتریال و برونشکتازی در این افراد : (1) تعداد کم سلول های B حافظه ای (memory) (2) کم بودن میزان پاسخ های آنتی بادی ضد پلی ساکاریدی (3) میزان IgAسرم بسیار پایین ( زیر 7میلی گرم در دسی لیتر). عفونت های مکرر فوقانی و تحتانی دستگاه تنفسی بیشتر توسط ارگانیسم های کپسولدار (پنوموکوک و HF) یا توسط باکتری های آتی پیک (مایکوپلاسما ) موجب اختلالات ریوی مثل برونشکتازی / افزایش ضخامت جدار برونش ها/ موکوس پلاک .

در این مطالعه از یک روش ELISAجدید جهت تعیین Abهای IgMوIgAضدPS23استفاده شده که پاسخ کلی نسبت به تمام پلی ساکاریدهای 23 ظرفیتی موجود در Pneumovax را مورد ارزیابی قرار میدهد.

متد مطالعه 125 بیمار مبتلا به CVID در محدوده سنی 16 -83 سال (15±48) . 62 مرد و 63 نفر زن . 20 نفر فرد سالم اهدا کننده خون در محدوده سنی 18- 67 سال که 13 تا مرد و 7 تا زن بودند وارد مطالعه شدند. تمام بیماران این مطالعه تحت درمان با IVIG با دوز ماهانه (300-400) mg/kg در فواصلی بودن که میزان IgG سرمی بالای 600 میلی گرم در دسی لیتر قرار بگیرد.

125 بیمار و 20 فرد سالم توسط pneumovax که حاوی پلی ساکارید 23 ظرفیتی بود واکسینه شدند. کینتیک آنتی بادی PSدر پاسخ به pneumovax در 20 فرد سالم درسرم انها در روزهای 0,28,360 بعد از واکسن مورد بررسی قرار گرفت. نمونه های خون بیماران مبتلا نیز در روزهای 0,28بعد از واکسیناسیون در -20 ذخیره شد. از 21 تفر از بیمارانی که پاسخ آنتی بادی از نوع IgA,IgM نشان داده بودن یکسال بعد از واکسیناسیون مجددا نمونه خون اخذ شد.

نتایج در 20 فرد سالم اهدا کننده خون میزان IgMاختصاصی ضد PS23 قبل از واکسیناسیون u/ml(56±35) وبعد از واکسن (363±712) رسید. در افراد سالم تیترIgA اختصاصی ضد PS23 قبل واکسن (62±46) بود که بعد واکسن به (305±508) رسید. در بیماران : میزانAnti- PS23 IgM قبل از واکسن ( 24/9±10/2 ) بود که بعد واکسن به ( 40/3±16/5 ) رسید. در مورد Anti- PS23 IgA قبل از واکسن ( 29/1±11/6 ) بود که بعد واکسن به ( 106±44/6 ) رسید. (P ≤ 0.0001)

غلظت های IgM ,IgA ضد PS23 بعد از واکسیناسیون با میزان IgMوIgA سرم هماهنگی داشت. از 97 بیمار با IgA توتال سرمی کمتر از 25 ، فقط 1 نفر 23Anti-PS IgA قابل اندازه گیری داشتند. از 28 بیمار با IgA توتال سرمی بیشتر از 25، فقط 13 نفر 23Anti-PS IgAقابل اندازه گیری داشتند. از 78 بیمار با IgM توتال کمتر از 22، فقط 3 نفر Anti- PS23 IgM قابل اندازه گیری داشتند. از 32 بیمار با IgM توتال بالای 22، 24 نفر Anti- PS23 IgM قابل اندازه گیری داشتند.

سرم 21بیماری که پاسخ IgMو یا IgA درروز 28 بعد واکسن نشان داده بودند ، یکسال بعد از واکسن مورد بررسی مجدد قرار گرفت. در 19 بیمار غلظت IgMو یا IgA اختصاصی مشابه آن چیزی بود که در روز 28 ام بعد واکسن بود. با این وجود 2 بیماری که بطور اولیه بعنوان IgM و IgA Responderتعریف شده بودند،در یکسالگی بعد از واکسن ،پاسخ Ab قابل detectای نداشتند. در این مطالعه cut offرا برای IgMاختصاصی u/mL 20درنظرگرفتن و برای IgA cut off را 150 در نظر گرفتن و بیماران را بدین ترتیب به 3 گروه تقسیم کردن.

گروه1 = Non- Responders: در اینها میزان IgM, IgAاختصاصی بعد از واکسن بسیار پایین بود که 88 بیمار (70 درصد بیماران ) را شامل میشود. گروه 2=Responders : میزان IgM و IgA اختصاصی بعد واکسن در اینها قابل detect بود که شامل 10 بیماربود. (8 درصد بیماران) گروه 3= IgM –only Responders که فقط IgM اختصاصی داشتند.که شامل 25 بیمار (20 درصد بیماران ) بود. ارتباط بین یک پلی ساکارید واحد و بررسی PS23: با بررسی ساده آماری وجود ارتباط خطی ضعیف بین غلظت های IgMوIgAاختصاصی قبل و بعد از واکسیناسیون با یک PSواحد بروش ELISAمشخص گردید. همینطور ارتباط خطی ضعیف بین IgMوIgAاختصاصی قبل وبعد از واکسیناسیون توسط PS23بروش ELISAمشخص شد.

ارتباط بین میزان B cellها و پاسخ های IgAو IgMضد PS23 : میزان توتال B cell، Native B cells، Transitional B cellsو CD21 low B cells در همه گروهها مشابه هم بود، ولی تعداد memory B cell ها در بین این گروهها متفاوت بود. اختلاف در فرکانس سلول های حافظه ای از نوع IgM بطور قابل ملاحظه ای در گروه Non- Responders در مقایسه با گروه Respondersوجود داشت P ≤ 0.002).) درمقایسه گروه Non- Responders با گروه IgM –only Responders در میزان سلول های IgM memory B cellsاختلاف آماری P ≤ 0.01)) وجود داشت.

در این مطالعه برای IgM memory B cells ،cut off limit را 20 cell/mm3را در نظر گرفتند. در گروه Non- Responders 27 نفر از 40 نفر در گروه Responders : 1 نفر از 10 نفر و در گروه IgM –only Responders : 5 نفر از 11 نفر میزان Memory B cellsها بطور قابل ملاحظه ای در گروه Non- Responders در مقایسه با گروه Responders کمتر بود واختلاف آماری داشت. P ≤ 0.003)). مقایسه میزان Memory B cells در گروه Non- Responders با گروه IgM –only Responders، P Value کمتر از0.05 دیده شد.

در مورد Switched memory B cells، 21 cell/mm3 را بعنوان Lower Limit حد نرمال در نظر گرفتند. در گروه Non- Responders :36 نفر از 40 نفر در گروه Responders : 3نفر از 10 مورد و در گروه IgM –only Responders :7 نفر از 11 مورد بود. وجود این اختلافات ،ارزیابی و بررسی 2 ایتم را پیشنهاد میکند: (1) فنوتایپ ایمنی B cellها (2) پاسخ به پلی ساکارید پنوموکوکی را که باید در زمان تشخیص بیماران مبتلا به CVIDبمنظور پی بردن به defect در سلول های B آنهاانجام شود.

بنابراین روش New ELISA ممکن است اطلاعات ایمونولوژیک بیشتری در سه گروه از بیماران مبتلا به CVID بما نشان بدهد پری والانس پنومونی در بیمارانی که Non- Responders بودند در مقایسه با بیمارانی که IgM –only Respondersو Respondersبودند از لحاظ آماری بترتیب( P ≤ 0.02و P ≤ 0.05). پری والانس برونشکتازی فقط در گروه Non- Respondersبالاتر بود. تظاهرات اتوایمون و انتروپاتی در هر سه گروه بیماران فرکانس مشابه داشتند. مشخص شد که میزان بسیار پایین total IgAسرم و میزان کم B cellsها جزو فاکتورهای پروگنوستیک حهت بروز عوارض عفونی ریوی در این بیماران است. استثنا آن 3 تا از 17 بیمار دچار پنومونی بودند که total IgAسرمی بالای 25 داشتند ولی IgAاختصاصی در انها قابل detectنبود.

از 13 بیمار مبتلا به پنومونی که میزان IgM memory B cellsنرمال داشتند، در 8 نفر میزان IgM,IgAاختصاصی قابل اندازه گیری نبود. نقص در Switched memory B cells در تمام بیماران دچار CVIDکه در آنها پنومونی بروز کرده بود وجود داشت.

در این مطالعه بجای استفاده از IgG ضد PSاز IgMو IgAاستفاده شد بخاطر اینکه این بیماران از قبل تحت درمان جایگزینی با Ig بودند. نیاز به شناسایی بیماران مبتلا به CVIDکه در ریسک عوارض ریوی هستند این امکان را بما میدهد که ارزش تست هایی را که پاسخ آنتی پلی ساکاریدی را چک می کنند را مورد بررسی قرار دهیم. در بیماران مبتلا به CVID، pictureایمونولوژیک و بالینی ممکن است با گذشت زمان تغییر کند حتی در بیمارانی که قبلا روی درمان های جایگزین قرار داشتند. همانطور که در این مطالعه در دو نفر از بیمارانی که ابتدا بعنوان Responderمشخص شده بودند ولی یکسال بعد از واکسیناسیون ،توانایی شون در حفظ پاسخ آنتی بادی اختصاصی را از دست دادند. این مطالعه در جهت اثبات نقش IgAو IgMاختصاصی در محافظت برعلیه عفونت پنوموکوکی است.

جهت ارزیابی وضعیت ایمنی فرد نسبت به پنوموکوک یا جهت تشخیص ایمنی هومورال غیرطبیعی میتوان از سرولوژی پنوموکوکی کمپلکس استفاده کرد. حتی در افراد سالم هم اختلافات بزرگی در پاسخ به واکسن میتواند مشاهده شود. از روش های دیگر برای تعیین و اندازه گیری سطح آنتی بادی اختصاصی ، روش ELISPOT است. که در یک مطالعه بر روی 37 بیمار مبتلا به CVIDانجام شد که توسط واکسن PS23 واکسینه شدند و نمونه سرم قبل و 7 روز بعد از واکسن از نظر Abهای اختصاصی IgG، IgA،وIgMمورد بررسی قرار گرفت که اکثر انها فاقد Abهای فوق بودند و 7 نفر از انها هم پاسخ های ضعیفی در مقایسه با گروه کنترل داشتند. در سایر مطالعات هم دیده شده که در بیماران دچار CVID بدون انجام واکسیناسیون و در عفونت های ریکارنت ریوی آنها ، کاهش تعداد IgM memory B cellsو کاهش IgM ضد پنوموکوکی وجود داشته است.

با این وجود تنها یک مارکر پروگنوستیک منحصر بفرد در عفونت های تنفسی بیماران CVIDنقش ندارد بلکه ترکیبی از عوامل در انها دخیل است که شامل : پایین بودن سطح IgA سرم پایین بودن تعداد IgM memory B cell پایین بودن IgMو IgA اختصاصی و استفاده از این تست ها بصورت ترکیبی بایستی هم در زمان تشخیص این بیماران و هم در طی دوره فالوآپ انجام شود.

پس این قانون کلی که سطوح IgAو یا IgM بسیار پایین سرمی با فقدان آنتی بادی IgAوIgMاختصاصی همراه هست ولی در عین حال تعداد کمی از بیماران از این قانون استثنا هستند . از آنجا که روش ELISAبسادگی میتواند با تعیین IgMوIgAضد PS23در ارزیابی پروگنوز پنومونی کمک کننده باشد ، پیشنهاد ما این است که تمام بیماران دچارCVIDتوسط واکسن های پنوموکوکی واکسینه شوند حتی اگر قبلش روی درمان های جایگزین قرار داشتند. با این اطلاعاتی که داریم نمی توان گفت که واکسیناسیون را بایستی بعنوان یک optionدرمانی در نظر گرفت، چرا که یک بررسی درازمدت در یک مطالعه کوهورت بزرگ از بیماران میتواند Efficacyکلینیکی واکسیناسیون را اثبات کند. ضمن اینکه ما نمی دانیم اگر از یک واکسن کنژوگه استفاده شود ، فرکانس پاسخ های متفاوت ممکن است عین همین باشد.

پس مطالعات جدید جهت دستیابی به اطلاعات بیشترو جمع اوری انها برای استفاده تشخیصی عمومی در حال انجام است. اینکه پاسخ بیماران مبتلا بهCVIDکه توسط واکسن Hibواکسینه شدند چگونه است؟ پاسخ نسبت به واکسن پلی ساکاریدی در بیمارانی که دچار CVIDنیستند ولی دچار کمبود Abهستند مثل بیماران دچار IgA Deficiencyبدون عفونت و یا بیماران دچار کمبود ساب کلاس IgGهمراه با IgA چگونه است ؟ در مطالعه اخیر در اروپا پاسخ نسبت به واکسن کربوهیدراتی جدید سالمونلا را ارزیابی کردند.

این تکنیک در مقایسه با روش ELISAبرای یک پلی ساکارید واحد و ELispoTروش سریعتر و آسانتری است. تفسیر نتایج آن در آزمایشگاههای مختلف اختلاف چندانی با هم ندارد. این روش مقایسه داده ها را هم برای اهداف تشخیصی و هم اهداف علمی بهبود میدهد. این روش برای شناسایی آندسته از بیماران مبتلا به CVIDکه در ریسک کمتری برای ابتلا به عفونت های تنفسی بدلیل ظرفیت سلول های Residual Bدر افزایش تولید پاسخ Abمیباشند، کمک کننده است. بنابراین روش New ELISAیک روش کمک ای است جهت ارزیابی پاسخ های Abاختصاصی که در شناسایی مارکرهای پروگنوز در بیماران مبتلا به CVIDموثرند ، نقش ارزشمندی دارد.