בעזרת microplate reader קביעת חלבון כמותית בעזרת microplate reader

* חשיבות: כמות חלבון/אנזים פעילות מעקב אחר תהליך בידוד וניקוי של חלבון קביעת חלבון כמותית חשיבות: כמות חלבון/אנזים פעילות מעקב אחר תהליך בידוד וניקוי של חלבון איפיון חלבון מסויים התכונות הנדרשות משיטת הכימות: סלקטיביות (selectivity) - חלבון X חומצת גרעין/סוכר רגישות (sensitivity) – mg, mg שיטות הכימות העיקריות מבוססות על תכונות הבליעה: photometric colorimetric *

חוק Beer: הבליעה a לריכוז העיקרון של כל שיטות המדידה הפוטומטריות חוק Beer: הבליעה a לריכוז

THE ELECTROMAGNETIC SPECTRUM Energy Wavelength (meter) Low > 1x10-1 Radio 1x10-1 - 1x10-3 Microwave 1x10-3 - 7x10-7 Infrared 7x10-7 - 4x10-7 Optical 4x10-7 - 1x10-8 Ultraviolet - UV 1x10-8 - 1x10-11 X- ray High < 1x10-11 Gamma-ray

שיטות כימות: ע"פי בליעה בתחום ה- uv: לדוגמה: בליעת חלבון ב l = 280 nm הבליעה נובעת משיירי tyrosine ו- tryptophan יתרון: שיטה פשוטה ומהירה – אין צורך בריאגנטים/טיפול החלבון נשמר במצבו המקורי לשימושים נוספים חסרון: בליעת חומצות גרעין ב l = 280 nm פי 10 יותר

2. ע"פי תגובת צבע (colorimetric assays): שיטות כימות: 2. ע"פי תגובת צבע (colorimetric assays): יתרון: אין בליעת חומצות גרעין ב l בתחום הנראה חסרון: החלבון אינו מתאים לשימושים נוספים BIURET LOWRY BRADFORD מדידה בתחום הנראה (optical) העיקרון המשותף: תמיסה הנמדדת + ריאגנט צבע a כמות/ריכוז החלבון

שיטת BIURET עיקרון: יצירת קומפלקס בין יוני נחושת דו-ערכיים (Cu2+) עיקרון: יצירת קומפלקס בין יוני נחושת דו-ערכיים (Cu2+) ואטומי חנקן בקשרים פפטידיים בח"א tyrosine tryptophan cysteine יתרון: מינימום הפרעות ע"י ריאגנטים הנמצאים בתמיסה חסרונות: רגישות לא גבוהה (mg) נפח הריאקציה = 5 ml הפרעה ע"י מלחי אמוניום

שיטת LOWRY הנפוצה ביותר עיקרון: תגובה של יוני נחושת דו-ערכיים בסביבה אלקלית (biuret) יוני נחושת חד-ערכיים + שיירים על ח"א אמפליפיקציה של הצבע ע"י תגובה עם folin tyrosine tryptophan cysteine l = 500 -750 nm

יתרונות: - UVרגישות פי 10 -20 שיטת LOWRY יתרונות: - UVרגישות פי 10 -20 Biuret - הגברת הרגישות ע"י תגובה עם folin: טווח: 10 – 100 mg נפח הריאקציה = 1ml חסרונות: תהליך דו-שלבי משך: ~ 40 – 60 דקות (UV – מיידי, BIURET ~ 30 דקות) רגישות ל pH (10 – 10.5) חלק מהמרכיבים לא יציבים הפרעה ע"י דטרגנטים, Tris, סוכרים, כו' הטווח הליניארי צר יחסית

עיקרון: מולקולת צבע coomassie blue G250 l מכס' = 465 nm שיטת BRADFORD עיקרון: מולקולת צבע coomassie blue G250 l מכס' = 465 nm קשירה לחלבון l מכס' = 595 nm קשירה לאיזורים הידרופוביים של החלבון בעיקר ח"א arginine & lysine שינוי בצבע: חום כחול l = 595 nm

רגישות יותר גבוהה פי 4 מ- :Lowry מיקרו = 1 – 20 mg מקרו = mg 200 – 20 שיטתBRADFORD יתרונות: מהירה 5 דקות נפח הריאקציה = 1- 5.5 ml רגישות יותר גבוהה פי 4 מ- :Lowry מיקרו = 1 – 20 mg מקרו = mg 200 – 20 מיעוט של הפרעות – בעיקר דטרגנטים חסרונות: לא מתאים לחלבונים עם מיעוט ח"א arginine ליניאריות פחות עקבית רקע גבוה (תמיסת Bradford חומה)

שיטה טווח הרגישות UV 20 mg – 3 mg Biuret 1 – 10 mg Lowry 10 – 100 mg Bradford 1 – 200 mg

מה באמת מודדות שיטות הכימות... מה באמת מודדות שיטות הכימות... BRADFORD arginine lysine UV tryptophan tyrosine BIURET אטומי חנקן LOWRY tryptophan tyrosine cysteine תכולה חריגה של השיירים הנמדדים תגרום להטעיה בקביעת ריכוז חלבון

עוצמת הבליעה של החומר הנבדק מכשור spectrophotometer Spectroscope + Photometer מודד את עוצמת האור שעוברת דרך התמיסה מייצר אור מונוכרומטי: l נתון עוצמת הבליעה של החומר הנבדק microplate (ELISA) reader - אותו העיקרון

מיכשור למדידות קולורימטריות ספקטרופוטומטר – מדידה ידנית יחידנית במבחנה / קיווטה (cuvette) microplate reader - מדידה מרוכזת ב"plate" רב-בארית רוחב הקיווטה = 1 cm השפעה לנפח הדגימה

שיטות קולורימטריות - עקומת כיול Standard curve בד"כ: BSA ייצוג אקראי של ח"א כמויות ידועות של החלבון + כמות קבועה של ריאגנט הצבע הנבחר ?

מהו הפתרון כאשר ריכוז החלבון> מהרגישות של שיטת הכימות? מיהול מיהול מיהול מיהול

מהו ה “blank” ? ריכוז החלבון הנמדד = 0 ריאגנט הצבע + תמיסה = מינימום הבליעה מוגדר כ- 0 בליעה מה חסרון השימוש במים כ “blank”?

THE END!

מתבצע בטמפ' החדר

xenon-flash lamps produce light over a broad spectrum, allowing measurements from 200 nm to 1000 nm.

Electromagnetic Spectrum - electromagnetic radiation can be described in terms of a stream of photons, each traveling in a wave-like pattern, moving at the speed of light and carrying some amount of energy. It was pointed out that the only difference between radio waves, visible light, and gamma-rays is the energy of the photons. “Electromagnetic” is another term for “light". Light waves are fluctuations of electric and magnetic fields in space. Photon – the smallest quantum (unit) of energy of light: it is defined to have zero mass & no electric charge

For example: hemoglobin appears red because the hemoglobin absorbs blue and green light rays much more effectively than red. The degree of absorbance of blue or green light is proportional to the concentration of hemoglobin. (Beer’s Law)