ارزیابی دستگاه شمارشگر سلولهای خونی دکتر آتوسا شریعت تربقانی آزمایشگاه مرجع سلامت

Cell count techniques Electrical Optical

Optical Principle Inlet Outlet Light Source Beam Aperture Photodiode

Constant Current Source Impedance Principle Container Aperture Tube with Aperture Cell 9% NaCl Electrolyte Vacuum Pump Constant Current Source Electrodes Direction of Flow

…problem Coincidence Carry over Post aperture recirculation

Images of Disposable unit (1st design)

Sources of Error Inadequate mixing Pipetting fault Inappropriate dilution Delay in transferring suspension to counting chamber Electric interference External noise Aperture blockage Aspiration failure Contaminated diluent Air bobbles Residual lysic agent Inadequate drainage

Calibration stability problems CV% Calibration stability RBC/ WBC imprecision linearity WBC incomplete lysis Platelet solution with dust imprecision

اولین قدم مطالعه کاتالوگ 5 روز آشنائی با نگهداری و کاربری و SET UP دستگاه استفاده از خون کنترل و رسم چارت کالیبراسیون دستگاه

بررسی خون گیری شرایط خونگیری غلظت ضد انعقاد ظرف مناسب درپوش مناسب شستشوی ظروف زمان آزمایش 1-4 ساعت مخلوط شدن با ضد انعقاد

شرایط سل کانتر نوسانات برق اتصال به زمین محلولها دفع زمینه

Background مناسب RBC < 0.03 × 10 12/l WBC < 0.04 × 10 9/l HGB < 0.2 g/l PLT < 5 ×10 9/l

نمونه حد اقل 5-3 دقیقه روی روتاتور و یا 20 بار با دست سر و ته شود حباب نداشته باشد لخته نداشته باشد

Each step in triplicate (each dilution read in duplicate) 10-20 normal individuals Hct can be corrected 1.5-3% 2% for 0.440.442%=0.0088 .44-.0088=0.43 CF(coefficient factor)= [(manual-analyzer) / (analyzer )]100

Example for calibration Sample manual mean cell counter mean 1 11,11.5,11 11.7 12,12,12 12 2 12,12.8,13 12.6 13,12.8,12.8 12.87 3 14,14.2,13.9 14.03 14.5,14.5,14.8 14.6 4 13,13.5,13.6 13.37 13.6,13.1,13.4 13.37 5 14.3,14.6,14.5 14.47 15,15,15.1 15.03 Mean(manual)=11.7+12.6+14.03+13.37+14.47 = 13.23 5 Mean(cell counter)=12+12.87+14.6+13.37+15.13=13.57 CF=(13.23 – 13.57 ) / 13.57 = -0.025 98 X (-0.025) = -2.45 → 98 – 2.45 = 95.55

EDTA Concentration 1.5 mg / cc or 3 mg / 2 cc Solution 3% 3 gr / 100 cc or 3000 mg /1000 30000 mg 1000 cc 3 mg X X= 0.1 cc or 100 µl Solution 6% 6 gr / 100 cc or 6000 mg /1000 60000 mg 1000 cc 3 mg X X= 0.05 cc or 50 µl

نمونه های مورد نیاز برای بررسی نمونه سالم نمونه لیپمی پلی سیتمی ( هموگلوبین 20-18 میلیگرم در دسی لیتر ) آنمی میکروسیتیک (MCV <75 fl , Hg=10-11 gr/dl) لکوسیتوز (WBC=20-40×10 9 /l) لکوپنی (WBC = 0.5-2 × 10 9 /l ) ترومبوسیتوز (PLt = 500-700 × 10 9 /l) ترومبوپنی (PLt = 50-80 × 10 9 /l) آنمی ماکروسیتیک (MCV>100 , Hg = 10-11 gr/dl) جاندیس (Bil > 30 µmol/l ) پاراپروتئینمی

1-بررسی عدم دقت (CV) خون کنترل بررسی منحنی کنترل –هر 5 روز نمونه های خارج از +4Sd را مردود کرده هر 5 روز دوباره میانگین انحراف معیار محاسبه شود در این مدت از محلولهایی بایک سری ساخت استفاده شود

روش اول 20 روز کاری هر روز دو نمونه که هر کدام را به صورت دوپلیکیت به دستگاه دهید اگر قدر مطلق تفاوت دو خوانده از 5/5 انحراف معیار بیشتر بود باید آن دو خوانده را حذف کرد.

Within-run

Total precision

روش دوم 10 نمونه خون تازه با دامنه های متفاوت که جهت انجام آزمایش CBC جمع آوری شده را در شرایط یکسان هر کدام را 10 بار آزمایش کرده سپس نمونه ها را در یخچال بگذارید.به مدت 5 روز نمونه ها را در پایان همانروز پس از آن که به دمای اطاق رسید دوباره مانند ران اول آزمایش کنید. در این صورت می توان برای هر روز به طور جداگانه SDوCV محاسبه کرده که به عنوان Within-run Precision خواهد بود. نتایج آزمایشهائی که در یک روز و طی 2 ران کاری آزمایش شده به عنوان Between-run Precision خواهد بود. برای بررسی Precision Between-day از خون کنترل استفاده شود نتایج آزمایشهای ده روز متوالی محاسبه شود.

روش سوم 20 روز هر روز یک نمونه کنترل را 20 آزمایش 20 روز هر روز یک نمونه کنترل را 20 آزمایش با کمک فرمولهای رایج ، عدم کنیددقت را محاسبه نمائید

مقادیرپیشنهادی برای بررسی CV Level 5 Level 4 Level 3 Level 2 Level 1 unit test 0.70 0.56 0.33 0.14 L/L Hematocrit 23 17 10.5 4.5 g/dl Hemoglobin 100 80 Fl Mean corpuscular volume 30 12 3 0.5 K/µl White blood cell count 1000 600 50 10 Platelet count

تفسیر نتایج CV قابل قبول برای within-run یا within-day برابر ( 0.25 ×TE ) می باشد CV قابل قبول برای between-day برابر TE) 0.33 ×T) می باشد

Test Allowable total error (TE ) Within-run CV Within-day CV White cell count Target + 15% 3.75% Erythrocyte count Target + 6% 1.5% Hematocrit Hemoglobin Target + 7% 1.75% Platelet count Target + 25% 6.25%

بررسی carry over ، یک نمونه high را سه بار پشت سر هم آزمایش کرده (H1,H2,H3) سپس یک نمونه low را سه بار آزمایش کنید(L1.L2.L) . نمونه های C / D نمونه های E / F نمونه های G / H سپس برای هر یک از پارامترها، با کمک فرمول زیر محاسبه نمائید. %carry over =

برای مثال اگر برای شمارش گلبول قرمز سه بار نمونه بالاو سپس سه بار نمونه پائین به شرح زیر باشد: 6.28-6.27-6.30 0.74-0.52-0.49 به روش زیر محاسبه خواهد شد نتایج را با ادعای سازنده مقایسه نمائید.

بررسی خطی بودن Linearity بدین منظور نمونه های لازم را به طور سریال رقیق کرده به طوری که در محدوده reportable range دستگاه باشد . سپس مقادیر فوق را با مقادیری که از طریق محاسبات آماری بدست آمده مقایسه نمائید. برای این مرحله نمونه های C و Eو G مورد نیاز می باشد. جهت پلاکت از نمونه فردی که با platelet rich plasma مخلوط شده استفاده نمائید. برای لکوسیت میتوان از نمونه بیمار مبتلا به CML استفاده کرد. برای هموگلوبین و گلبول قرمز پارامترهای MCV.MCH.MCHC محاسبه شود. جهت رقیق کردن از پلاسمای فرد استفاده شود

تهیه رقت برای هر یک از پارامترها ،حد اقل پنج رقت تهیه گردد و هر نمونه را دو تا سه بار آزمایش کرده ، میانگین را به کار برید. Low pool High pool Mixture 1 5 part 0% Mixture2 3 part 1 part 25% Mixture3 2 part 50% Mixture4 75%

تفسیر برای هر رقت، دو نتیجه ثبت نمائید یکی نتیجه آزمایش با دستگاه و یکی نتیجه ریاضی محاسبه شده منحنی رگرسیون خطی دو سری اعداد ( سری اول مقادیر آزمایش شده و سری دوم مقادیر محاسبه شده است) را بدست آورید. همبستگی این دو باید به صورت R2 > 0.95 باشد.

بررسی درستی (Bias) حداقل نمونه خون 100 فرد که شامل افراد سالم و بیمارباشد ، با دستگاه فوق و سیستم قابل قبول مورد آزمایش قرار میگیرد. بهتر است هر نمونه را به صورت دوپلیکیت آزمایش کرد تا از خطای راندوم جلوگیری شود بهتر است نمونه ها طی روزهای مختلف ( 20 روز ) آزمایش شود بهتر است نمونه ها را در فاصله زمانی کوتاه ( ترجیحاً بلافاصله ) توسط دو دستگاه آزمایش کرد تا پارامترهای خونی در اثر گذشت زمان تغییر نکنند تبصره : لازم به ذکر است که باید تمام نکات لازم برای تهیه ی نمونه خون CBC ،مانند ضد انعقاد مناسب ، زمان انجام آزمایش ، مخلوط کردن و ..... مد نظر گرفته شود .

طبق پیشنهاد FDA دستگاه سل کانتر با روش مرجع ،مورد مقایسه قراربگیرد به همین دلیل برای پارامتر های هموگلوبین و هماتوکریت و همچنین شمارش افتراقی گلبولهای سفید، از روش دستی با کارشناسان کارآزموده و تهیه حداقل دو گسترش برای هر نمونه ،استفاده می گردد. تبصره: روش انجام آزمایش های فوق طبق دستورالعمل های CLSI باشد

پس از انجام آزمایشها ، نتایج را با محاسبه R2 و Slop – intercept-Bias مورد مقایسه قرار میدهیم. اگر چه برای تفسیر نتایج از محاسبه T duplicate test هم استفاده می کنیم . برای flag NRBC & flag immature cell با توجه به گسترشهای تهیه شده، حساسیت و اختصاصیت را محاسبه می کنیم

بررسی مخلوط شدن( mixing study) این ارزیابی در مورد دستگاههائی صورت میگیرد که سیستم مخلوط کردن اتوماتیک نمونه را دارند. برای این کار شمارش گلبولهای قرمز را ملاک قرار دهید. 14 نمونه را 10 بار سروته کرده و هرکدام را 3 بار آزمایش کرده ، میانگین را برای هر نمونه به عنوان مقدار پایه baseline در نظر گرفته میشود. نمونه هارا 4 ساعت در دمای اطاق قرار داده بدون آنکه نمونه هارا تکان دهید با سیستم اتوماتیک مورد آزمایش قرار دهید. نمونه ها را با دست سروته کرده و دوباره با سیستم اتوماتیک دستگاه آزمایش کنید.

به عنوان مثال نمونه اول سه بار، آزمایش و نتایج در جدول ثبت شده است. نتایج را در دو مرحله سوم و چهارم با مقادیر پایه ( مرحله اول ) مقایسه کنید. اختلاف تا baseline 1.5% قابل قبول میباشد. به عنوان مثال نمونه اول سه بار، آزمایش و نتایج در جدول ثبت شده است. RBC1 Run1 4.1 Run2 4.12 Run3 4.11 Average 4h Unmixed 4.09 4h Premixed 4.13 Change unmixed% 0.49 Change premixed % -0.49 <1.5% ok

4.1+4.12+4.11 / 3 = 4.11 میانگین محاسبه شده مطابق مرحله سوم ،بدون مخلوط کردن آزمایش شده و 4.09 بدست آمده است. مطابق مرحله چهارم پس ازمخلوط کردن با دست ، آزمایش انجام شده 4.13

EQAS در صورت امکان ، از این دستگاه در برنامه ارزیابی خارجی کیفیت استفاده شود و در مقایسه با سایر سیستمهای موجود قرار بگیرد.

بررسی نرم افزار در حین کار باید به نحوه کار با نرم افزار دستگاه توانائی های آن و user friendly بودن آن نیز توجه کرد. GP19-A Laboratory Instruments and Data Management Systems: Design of Software User Interfaces and End-User Software Systems Validation, Operation, and Monitoring; Approved Guideline

General Principles of Software Validation; Final Guidance for Industry and FDA Staff Document issued on: January 11, 2002   U.S. Department Of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Devices and Radiological Health Center for Biologics Evaluation and Research GP19-A Laboratory Instruments and Data Management Systems: Design of Software User Interfaces and End-User Software Systems Validation, Operation, and Monitoring; Approved Guideline , CSLI

1- ( Homogeneity) كنترل كيفيت نمونه Homogenous Non-homogenous

Homogeneity Test بعد از اينكه نمونه ها بسته بندي و آماده ارسال شد بايد اين كار انجام شود. تعداد مناسبي از نمونه ها( 5%) به صورت تصادفي انتخاب شود به طوريكه از تمام جعبه ها باشد. هر نمونه دو بار به سل كانتر داده شود.

Standard DEVIATION OF SAMPLE AVERAGE بار اول بار دوم X X1.1 X1.2 X1 X2.1 X2.2 X2 X3.1 X3.2 X3 …… ….. ….

Within sample standard deviation بار اول بار دوم Wt Wt2 X1.1 X1.2 X1.1-X1.2 (X1.1-X1.2)2 X2.1 X2.2 X2.1-X2.2 (X2.1-X2.2)2 X3.1 X3.2 X3.1-X3.2 (X3.1-X3.2)2 ……. …….. ……….  Duplicate test

Between sample standard deviation Ss  0.3 sd test for program

پايداري در يخچال Stable Unstable

2-(Stability) كنترل كيفيت نمونه تعدادي از نمونه ها را انتخاب كرده ( حد اقل سه نمونه ) تا زماني كه آخرين جواب آزمايشگاهها دريافت و ران كاري بسته شد نگه داشته شود(در شرايط مناسب) سپس هر نمونه را دو بار آزمايش كرده ميانگين نتايج را محاسبه كرده ميانگين حاصله را با ميانگين هموژنيتي مقايسه كنيد  0.3 sd testميانگين پايداري – ميانگين هموژنيتي

CLIA rules for Hematology Test or Analyte Acceptable Performance White cell differentiation Target ± 3 SD based on percentage of different types of white cells Erythrocyte count Target ± 6% Hematocrit Hemoglobin Target ± 7% Leukocyte count Target ± 15% Platelet count Target ± 25%

پايداري در دماي اطاق با درب بسته پس از باز شدن درب چند ويال را به طور تصادفي انتخاب كرده چند ويال را با درب باز و چند عدد را با درب بسته در دماي اطاق نگه ميداريم. هر ساعت و يا هر نيم ساعت آزمايش مي كنيم (بخصوص با درب بسته بسيار اهميت دارد زيرا تخميني از شرايط توزيع بدون زنجيره سرد داريم)

با تشکر