ЕЛЕКТРОФОРЕЗА

Агароза-Гел Електрофореза Гел електрофорезата е техника што се употребува за анализа на НУКЛЕИНСКИ КИСЕЛИНИ и ПРОТЕИНИ. Агароза-гел Електрофорезата рутински се употребува за подготовка и анализа на ДНА. -Агароза-Гел Електрофорезата е процедура што се употребува за СЕПАРАЦИЈА на молекулите врз база на нивната БРЗИНА НА ДВИЖЕЊЕ низ ГЕЛ под влијание на електрично поле.

http://www.personal.psu.edu/pzb4/electrophoresis.swf

DNA е негативно набиена молекула при рН од 7.00 поради фосфатните групи (PO43-)што се присутни во нејзината структура

+ - DNA H  O2  • DNA е негативно набиена молекула. Батерија Scanning Electron Micrograph of Agarose Gel (1×1 µm)  • агарозата е порозен полимер, што овозможува движење на DNA

+ - Колку брзо ќе се движи DNA? DNA small large -зависи од јачината на електричното поле, рН на пуферот, Густината на гелот агароза… и од ГОЛЕМИНАТА на DNA! *Малите DNA молекули се движат побрзо отколку големите DNA …значи со гел електрофорезата се врши сепарација на DNA според големината DNA + - батерија small large Внатре во агарозата, линеарната DNA мигрира обратно пропорционално од log10 на нејзината моларна маса.

Агарозата е линеарен полимер што се екстрахира од морските алги. Agarose D-galactose 3,6-anhydro L-galactose Sweetened agarose gels have been eaten in the Far East since the 17th century. Agarose was first used in biology when Robert Koch* used it as a culture medium for Tuberculosis bacteria in 1882 Агарозата е линеарен полимер што се екстрахира од морските алги.

Раздвојување на протеини и аминокиселини со електрофореза Протеините се полимерни молекули изградени од АМИНОКИСЕЛИНИ и тие при одредено рН имаат ПОЛНЕЖ Тоа значи со регуирање на рН на пуферите, може да се Регулира и полнежот кај протеините, а тоа доведува до нивна сепарација со електрофореза

Electrophoresis Cation = позитивен јон, се движи спрема катодата (-) Anion = негативен јон, се движи кон анодата (+) амфотерна супстанца (звитер јон)= може да има позитивеннегативен/нула полнеж, во зависност од рН Принцип: Некои супстанци имаат различен вкупен полнеж и доколку се внесат во електрично поле, истите можат селвенционано да се раздвојат. Брзината на дадена молекула СО ПОЛНЕЖ зависи од: големината, формата и аплицираниот потенцијал

Електрофореза на агароза гел на серумски протеини Принцип: Серумските протеини имаат негативен полнеж при pH 8.6 (константо pH се одржува со пуфер) и тие се движат кон анодата. Брзината на движење на разни серумски протеини зависи од нивниот вкупен полнеж Протеините што се раздвојуваат се фиксираат во форма на дамки со „amidoblack раствор„.

Протеинските серуми се испитуваат со хоризонтална геле елктрофореза The figure was found at http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2250/Week_Three/electro4.jpg

Процес на електрофореза 1. Апликација на примерок 2. Прилагодување на напонот и струјата- Еднонасочна струја! (gel-electrophoresis околу 70 - 100 volts) 3. Време на сепарација: минути (e.g. gel-electrophoresis на серум протеини е 30 min.) 4. Електрофореза во пуферот: фиксација, формирање на „дамки“ и „гуибење на дамки“ 5. Евалуација т.е. Анализа на одговорите од електрофорезата: Квалитативна (со примена на стандарди) Квантитативна (со примена на денситометрија)

Контејнери за развивање на „оттисоците„ на гелот Equipment used for the gel electrophoresis in the practical training A1 Извор на напот Контејнери за развивање на „оттисоците„ на гелот Келија за електрофоре за апликатор

Serum protein electrophoresis Hydragel – agarose gel Серумските протеини се сепарираат во 6 групи: Albumin α1 - globulins α2 - globulins β1 - globulins β2 - globulins γ - globulins Figure is found at http://www.sebia-usa.com/products/proteinBeta.html#

Квантификација на сепарираните протеини ДЕНЗИТОМЕТРИЈА Дензитометар е инструмент што се употребува за определување на сепарираните протени во гелот преку скенирање на гелот. Со скенирање на оттисоците од протеините се добива КВАНТИТАТИВНА ИНФОРМАЦИЈА за фракцијата на дадени протеини.

Серумски протеини при дијагностика на болести-нормални вредности Референтни вредности: Total protein 6.0 – 8.0 g/dL Albumin 3.5 – 5.0 g/dL α1-globulins 0.1 – 0.4 g/dL α2-globulins 0.4 – 1.3 g/dL β-globulins 0.6 – 1.3 g/dL γ-globulins 0.6 – 1.5 g/dL

Електрофореџза на серумски протеини при Акутно воспаление При воспаление предизвикано од инфекција или од хируршки трауми Нормален ↓ albumin опаѓа ↑ α1 и α2 globulins расте α1 α2-globulins Figure is found at http://erl.pathology.iupui.edu/LABMED/INDEX.HTM

Chronic inflammatory response α1 α2 γ-globulins забвавен одговор е поврзан со хронични инфекции (автоимуни болести, хронични заболувања на црн дроб, канцер ....) ↓ albumin ↑α1 и α2 globulins ↑↑ γ globulins Figure is found at http://erl.pathology.iupui.edu/LABMED/INDEX.HTM

ЦИРОЗА γ-globulins Цироза –зголемена конзумација на алкохол или хепатит ↓ albumin ↓ α1, α2 и β globulins ↑ Ig A in γ-fraction Figure is found at http://erl.pathology.iupui.edu/LABMED/INDEX.HTM

Агароза гел се припрема со мешање на агароза што е во форма на прашак и некој пуферски раствор. Пуфер Сад во кој се врши загревање на смешата Агароза

Уред за електрофореза Батерија Сад во кој се става гелот поклопец електроди  Casting tray Чешли за гелот

Gel casting tray & combs

Preparing the Casting Tray Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray.

Agarose Buffer Solution Combine the agarose powder and buffer solution. Use a flask that is several times larger than the volume of buffer.

Melting the Agarose Agarose is insoluble at room temperature (left). The agarose solution is boiled until clear (right). Gently swirl the solution periodically when heating to allow all the grains of agarose to dissolve. ***Be careful when boiling - the agarose solution may become superheated and may boil violently if it has been heated too long in a microwave oven.

Pouring the gel Allow the agarose solution to cool slightly (~60ºC) and then carefully pour the melted agarose solution into the casting tray. Avoid air bubbles.

Each of the gel combs should be submerged in the melted agarose solution.

When cooled, the agarose polymerizes, forming a flexible gel When cooled, the agarose polymerizes, forming a flexible gel. It should appear lighter in color when completely cooled (30-45 minutes). Carefully remove the combs and tape.

Place the gel in the electrophoresis chamber.

DNA buffer   wells    Anode (positive) Cathode (negative) Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth of at least 1 mm. Make sure each well is filled with buffer.

Sample Preparation Mix the samples of DNA with the 6X sample loading buffer (w/ tracking dye). This allows the samples to be seen when loading onto the gel, and increases the density of the samples, causing them to sink into the gel wells. 6X Loading Buffer:   Bromophenol Blue (for color)  Glycerol (for weight)

Loading the Gel Carefully place the pipette tip over a well and gently expel the sample. The sample should sink into the well. Be careful not to puncture the gel with the pipette tip.

Running the Gel Place the cover on the electrophoresis chamber, connecting the electrical leads. Connect the electrical leads to the power supply. Be sure the leads are attached correctly - DNA migrates toward the anode (red). When the power is turned on, bubbles should form on the electrodes in the electrophoresis chamber.

Cathode (-)  wells  Bromophenol Blue Gel Anode (+) DNA (-)  After the current is applied, make sure the Gel is running in the correct direction. Bromophenol blue will run in the same direction as the DNA.

DNA Ladder Standard -  100  200  300  1,650  1,000  500  850  650  400  12,000 bp  5,000  2,000 DNA migration Note: bromophenol blue migrates at approximately the same rate as a 300 bp DNA molecule bromophenol blue + Inclusion of a DNA ladder (DNAs of know sizes) on the gel makes it easy to determine the sizes of unknown DNAs.

As an alternative to purchasing costly DNA ladders, one can be created using meal worm (Tenebrio molitor) DNA and a restriction enzyme. http://people.uis.edu/rmosh1/DNAexerciseVIIa02.pdf

Staining the Gel • Ethidium bromide binds to DNA and fluoresces under UV light, allowing the visualization of DNA on a Gel. • Ethidium bromide can be added to the gel and/or running buffer before the gel is run or the gel can be stained after it has run. ***CAUTION! Ethidium bromide is a powerful mutagen and is moderately toxic. Gloves should be worn at all times.

Safer alternatives to Ethidium Bromide  Methylene Blue  BioRAD - Bio-Safe DNA Stain Ward’s - QUIKView DNA Stain Carolina BLU Stain …others advantages Inexpensive Less toxic No UV light required No hazardous waste disposal disadvantages Less sensitive More DNA needed on gel Longer staining/destaining time

Staining the Gel • Place the gel in the staining tray containing warm diluted stain. • Allow the gel to stain for 25-30 minutes. • To remove excess stain, allow the gel to destain in water. • Replace water several times for efficient destain.

Ethidium Bromide requires an ultraviolet light source to visualize

Visualizing the DNA (ethidium bromide)  100  200  300  1,650  1,000  500  850  650  400 5,000 bp  2,000 DNA ladder  PCR Product 1 2 3 4 5 6 7 8 wells + - - + - + + - Primer dimers Samples # 1, 4, 6 & 7 were positive for Wolbachia DNA

Visualizing the DNA (QuikVIEW stain) DNA ladder  wells PCR Product  2,000 bp  1,500  1,000  750  500  250 + - - - - + + - - + - + Samples # 1, 6, 7, 10 & 12 were positive for Wolbachia DNA March 12, 2006