תרגול מס' 3: קינטיקה אנזימטית יוספזון אוהד מעבדתו של ד"ר עאזם חדר 624, בניין שרמן iosefson@post.tau.ac.il

א) אותו pH אופטימלי לריאקציה. ב) אותה טמפרטורה אופטימלית לריאקציה. שני אנזימים מאורגניזמים שונים מקטלזים את אותה ריאקציה. צפוי כי לשתי הריאקציות המקוטלזות אנזימטית יהיה את התכונה הבאה: א) אותו pH אופטימלי לריאקציה. ב) אותה טמפרטורה אופטימלית לריאקציה. ג) אותו Km . ד) אותו קבוע שווי משקל. ה) אותם ערכי Vmax. אנזימים יגבירו את קצב הריאקציה ע"י הקטנת אנרגיית האקטיבציה, אבל לא ישפיעו על שיווי המשקל של הריאקציה!

מאיזה חץ ניתן לחלץ את קבוע קצב המהירות של הריאקציה בהעדר אנזים. א) A. ב) B. ג) C. ד) D. ה) E. מאיזה חץ ניתן לחלץ את קבוע קצב המהירות של הריאקציה בנוכחות אנזים. א) A. ב) B. ג) C. ד) D. ה) כל התשובות אינן נכונות.

אנזימים יכולים להגביר את קצב הריאקציה פי 107 – 104 ע"י הקטנת אנרגיית האקטיבציה איך אנזימים מורידים את אנרגיית האקטיבציה ? 1. ע"י סידור מחדש של קשרים קוולנטיים במהלך הריאקציה האנזימטית. למשל: קבוצות פונקציונליות באנזים יכולות להקשר קוולנטית לסובסטרט באופן זמני, ובכך לאקטב אותו להמשך הריאקציה. קבוצות יכולות לעבור זמנית מהסובסטרט אל האנזים לקבלת תוצר ביניים בעל אנרגיה נמוכה יותר. אינטראקציות אלו בין האנזים לסובסטרט מספקות מסלול ריאקציה חלופי בעל אנרגיה נמוכה יותר. 2. בעזרת אנרגיית הקישור בין האנזים לסובסטרט. אנרגית הקישור, שמקורה אינטראקציות לא קוולנטיות, ספציפיות, בין הסובסטרט לקבוצות פונקציונאליות של האנזים, מהווה את המקור העיקרי לאנרגיה החופשית המשמשת את האנזים להורדת אנרגיית האקטיבציה של הריאקציה. האינטראקציה האופטימלית בין האנזים לסובסטרט מתרחשת רק במצב המעבר.

התיאוריה של מיכאליס-מנטן k1 k2 E + S ES E + P k-2 k-1 הנחות המודל : היות ונמדדת המהירות ההתחלתית V0 k-2 זניח (בתחילת הריאקציה כמות התוצר זניחה). היות והמדידות נערכות בתנאים התחלתיים בהם [S]>>[E] כמות הסובסטרט שקשור לאנזים זניחה ביחס לריכוז הסובסטרט הכללי. פירוק הקומפלקס ES ל-E ו-P הוא השלב האיטי (מגביל את קצב הריאקציה) הוא שלב קובע המהירות V0 = k2[ES] הנחת המצב העמיד (steady state kinetics) של הקומפלקס ES (מהירות יצירת הקומפלקס שווה למהירות פירוקו ריכוז ES אינו משתנה).

משוואת מיכאליס-מנטן k Km + = - 1 2 Initial עבור [E] קבוע !!!

קיימת תלות לינארית בין ריכוז הסובסטרט למהירות ההתחלתית של הריאקציה. כאשר [S] קטן ... קיימת תלות לינארית בין ריכוז הסובסטרט למהירות ההתחלתית של הריאקציה. משמעות ביולוגית: אנזים עם KM גבוה יחסית לריכוזים הפיזיולוגיים של הסובסטרט, לא יהיה בדרך כלל רווי בסובסטרט, והפעילות הקטליטית שלו תשתנה בהתאם לשינוי בריכוז הסובסטרט. קצב הופעת התוצר יהיה תלוי בזמינות של הסובסטרט בתא.

וכאשר [S] גדול ... V0 = Vmax משמעות ביולוגית: אנזים עם KM נמוך יחסית לריכוזים הפיזיולוגיים של הסובסטרט, יהיה בדרך כלל רווי בסובסטרט, ויקטלז פחות או יותר, בקצב קבוע מבלי להתחשב בשינויים בריכוז הסובסטרט בטווח הפיזיולוגי

כאשר V0=1/2Vmax Km = [S] כאשר ריכוז הסובסטרט שווה ל- Km אזי מהירות הריאקציה שווה למחצית המהירות המקסימלית Initial

[ ] [ ] k Km + = k = k K = k S E [ ] משמעות Km - 1 2 - 1 1 ES d - 1 לריכוז התאי של הסובסטרט שלו (עובדה ניסויית). טעות נפוצה: להתייחס ל Km כמדד לאפיניות בין האנזים לסובסטרט. אבל ברוב המקרים יש להתייחס ל-Km רק כריכוז הסובסטרט הדרוש להגיע לחצי מהמהירות המקסימלית. למעט מקרה פרטי שבו k-1>>k2 : k Km + = - 1 2 k = - 1 k 1 בהתבסס על הנחת המצב העמיד, על פיו ריכוז הקומפלקס ES נשאר קבוע k1[E][S] = k-1[ES] רק במקרה זה, שבו Kd = Km, Km יהווה מדד לאפיניות בין האנזים לסובסטרט Kd גדול אפיניות נמוכה. Kd קטן אפיניות גבוהה. [ ] [ ] [ ] K ES d = k - 1 S E

תצוגה גרפית של קינטיקה אנזימטית עבור [E] קבוע Vmax – המהירות המקסימאלית, בה מתרחשת התגובה בנוכחות אנזים Km – ריכוז הסובסטרט הדרוש כדי להגיע ל- Vmax/2

בריאקצית מיכאליס מנטן החלק המתאר את מהירות הריאקציה הוא: Aׁ(k1([Et] - [ES])[S]. B) k-1[ES] + k2[ES]. C) k2[ES]. D) k-1[ES]. E) k1([Et] - [ES]). פירוק הקומפלקס ES ל-E ו-P הוא השלב האיטי (מגביל את קצב הריאקציה) הוא שלב קובע המהירות V0 = k2[ES] K1 K-1 K2

לאנזים יש ערך Km=0.005 M . באיזה ריכוז סובסטרט מהירות הריאקציה ההתחלתית תהיה רבע ממהירות הריאקציה המכסימלית. א) 0.00167 M . ב) 0.0025 M . ג) 0.000167 M . ד) 0.005 M . ה) 0.00125 M . מיכאליס מנטן רגיל. ומה הייתה התשובה אם היה נתון שברבע מהמהירות המקסימילית KM גדול מאוד מריכוז הסובטרט הדרוש להגיע אליה?

היחידות של kcat הן זמן/1 והוא מוגדר גם כ- Turn Over Number- קבוע ריאקציה כללי המתאר את השלב קובע המהירות ברוויה. בריאקציית מיכאליס מנטן - היחידות של kcat הן זמן/1 והוא מוגדר גם כ- Turn Over Number- מספר מולקולות סובסטרט ההופכות לתוצר ביח' זמן ע"י מולקולת אנזים אחת, כאשר האנזים רווי בסובסטרט. Specificity Constant (היחס kcat/km): הינו מדד ישיר ליעילות האנזים והספציפיות שלו . קיים גבול עליון ליחס זה ( (108-109 M-1sec-1 שנובע מהקצב שבו E ו-S מדפייזים בתמיסה מימית. בערך זה נדע שהאנזים יעיל עד כדי כך שמה שמגביל אותו זה קצב הדיפוזיה בלבד(catalytic perfection) .

Lineweaver-Burk equation 1 V0 Km Vmax [S] = + 1/V0=0 Km Vmax 1 [S] = - 1/V0 Slope = Km/Vmax 1/S=0 1 V0 = Vmax 1/Vmax -1/Km 1/[S]

A B C Km הוא קבוע מהותי של האנזים ואינו תלוי בריכוזו. עבור ריאקציה אנזימטית הכוללת סובסטרט יחיד נקבעו העקומות המייצגות את 1/V כתלות ב- 1/S של שלושה ריכוזי אנזים שונים. איזה מבין התרשימים הבאים נצפה לקבל? (כל צבע מייצג ריכוז אנזים שונה) איזה תרשים נצפה לקבל A B C Km הוא קבוע מהותי של האנזים ואינו תלוי בריכוזו.

שאלה מס' 32 נמדדו מהירויות יצירת התוצר (V0) של אנזים מסוים בריכוזי סובסטרט שונים. האם אנזים זה מתנהג לפי מיכאליס-מנטן? אם כן (או לא) איזה הסבר יש לתופעה? [S] mM V0 mmol/min 0 0 1 3 2 5 4 6.5 8 7 12 6.2

מהירות התחלתית של הריאקציה כפונקציה של ריכוז הסובסטרט שאלה מס' 32 מהירות התחלתית של הריאקציה כפונקציה של ריכוז הסובסטרט V0 [S] 3 1 5 2 6.5 4 7 8 6.2 12 1/V0 [S] / 1 0.333333 1 0.2 0.5 0.153846 0.25 0.142857 0.125 0.16129 0.083333

[S] M V0 mmol/min V0 mmol/min שאלה מס' 33 אנזים אחד מקטלז את הריאקציה שבה נהפך גלוקוז לתרכובת B ומאנוז לתרכובת C. בשתי הריאקציות k+2 <<<< k-1 . נתונה טבלה של ריכוז הסובסטרט כנגדV0 מה תוכל להסיק לגבי Vmax, Km , וקבוע הדיסוסיאציה של שתי התרכובות עם האנזים. [S] M V0 mmol/min V0 mmol/min 1 x 10-5 150 82 2x10-5 256 150 1x10-4 600 450 3x10-4 770 670 5x10-4 818 750 אם נתון שבתערובת הריאקציה יש mmol 2 אנזים מה ה turn over number של האנזים ? בשאלה זו נתון ש- K-1 גבוה בהרבה מ-K2 ומכאן שבמקרה זה, KM יהווה מדד לאפיניות בין האנזים לסובסטרט

1/Vmax = 0.0011; Vmax = 909 mmol/min Km1 = 9.9x10-5 M Km2 = 5x10-5 M שאלה מס' 33 1/Vmax = 0.0011; y = 1.1*10-7x + 1.1x10-3 Vmax = 909 mmol/min Km1 = 9.9x10-5 M Km2 = 5x10-5 M [Et] = 2 mmol y = 5.6*10-8x + 1.1x10-3 T.O.N = 909/2 = 454 min-1

אנזימים אלוסטריים חלבון אלוסטרי : חלבון בו קישור של אפקטור או סובסטרט משפיע על תכונות הקישור באותו חלבון. Allos = “other” stereos = “shape”. אנזים אלוסטרי מורכב ברוב המקרים משתי תת יחידות או יותר. בגרף V ל-[S] מתקבלת עקומה סיגמואידית אופיינית הליגנד שניקשר מתנהג כאקטיבטור או כמעכב אקטיבטור אלוסטרי: גורם לאנזים לקשור את S יותר טוב. מעכב אלוסטרי: גורם לאנזים לקשור את S פחות טוב. +Activator +Inhibitor No Activator or Inhibitor

סוגי מעכבים לריאקציות אנזימתיות חומרים המאיטים או העוצרים לחלוטין ריאקציות אנזימתיות. רבים מחומרים אלו משמשים כתרופות. V0 [I] מעכב בלתי הפיך מעכב הפיך מעכב הפיך תחרותי מעכב הפיך לא תחרותי Uncompetitive מעכב הפיך לא תחרותי Mix Noncompetitive

מעכב בלתי הפיך קישור קוולנטי (נפוץ) או אסוציאציה לא קוולנטית חזקה במיוחד של המעכב לאנזים הגורמים להרס קבוצה פונקציונלית החיונית לפעילותו של האנזים. מהווים כלי חשוב בלימוד מנגנוני ריאקציות (חא' באתר פעיל). suicide inactivators – מעכבים בלתי הפיכים, הפעיל רק לאחר שנקשרו לאתר הפעיל של אנזים ספציפי תרופות עם מעט תופעות לוואי .

Noncompetitive (Ki=K’i) Km

מיקרומול TLCK קשור ל-X מיקרומול של סובסטרט 34) נמצא שהחומר TLCK מעכב את הפעילות של פרוטאזה X. נלקחו דוגמאות שמכילות 14 מ"ג X וטופלו ב- TLCK בריכוזים שונים. כמות הסובסטרט שעוברים ביקוע בדקה נמדדה (טבלה). הניסיון בוצע בריכוז סובסטרט פי 40 מה- Km של האנזים. * לקרוא בחומר המצורף באתר. מיקרומול TLCK קשור ל-X מיקרומול של סובסטרט שעבר ביקוע בדקה 0 8.1 0.2 6.2 0.4 4.3 0.6 2.4 0.7 1.4 0.8 0.49 (I) TLCK הנו : א) מעכב תחרותי של X. ב) מעכב לא תחרותי של X. ג) מעכב לא הפיך של X. ד) כל התשובות לא נכונות (II) המשקל המולקולרי של השרשרת הפוליפפטידית של X הינו: א) 8235 דלטון. ב) 16470 דלטון. ג) 32940 דלטון. ד) 25000 דלטון. III) ה- Turnover number של X הנו: א) min-1 9.5 . ב) min-1 1950 . ג) min-1 9500 ד) כל התשובות לא נכונות.

שאלה מס' 34 א. 0.49 0.8 1.4 0.7 2.4 0.6 4.3 0.4 6.2 0.2 8.1 Activity [I]

שאלה מס' 34 ב. ג.

בעקומות המוצגות לפניכם, העלאת ריכוז המעכב: א) תגדיל את VMAX ב) תקטין את KM / VMAX ג) תגדיל את Km / Vmax ד) תקטין את KM

יחידת אנזים – Enzyme unit (EU or U) 1EU – כמות האנזים ההופכת 1µmole סובסטרט לתוצר בדקה. פעילות ספציפית – Specific activity (SA) SA – מספר יחידות האנזים ב – mg חלבון. (EU/mg protein=Vmax/mg protein) זהו מדד לניקיון האנזים. נמדדים בתנאי Vmax, בהם כל מולקולות האנזים רוויות בסובסטרט.

Turn over number (T.O.N or TN) Kcat דרגת ניקוי פי כמה ניקינו את החלבון מסך תערובת חלבונים. SA אחרי שלב הניקוי חלקי SA לפני שלב הניקוי של האנזים. % ניצולת - Yield מספר יחידות האנזים בתערובת החלבונים לעומת מספר יחידות האנזים בסוף תהליך הניקוי. % yield = 100 X (EUafter/EUbefore) Turn over number (T.O.N or TN) Kcat מקסימום מספר מולקולות סובסטרט שהופכות לתוצר ע"י אנזים אחד ביחידת זמן. Kcat = Vmax/[E]T TN = µmole substrat/min=Vmax=Vmax 1/TN משך מחזור קטליטי µmole enzyme n m/MW

Anion exchange chromatography Preparation Volume (ml) Protein mg/ml Activity U/ml Specific U/mg Yield Degree of purification Crude extract 200 2.5 100 (NH4)2SO4 precipitate 80 1.25 Anion exchange chromatography 20 1 500 Cation exchange 5 1500 Gel filtration 3 0.3 2000 Crystallization 0.5 5000 100% 40 80% 4 160 500 50% 12.5 250 25% 10,000

1 µg (47 של אנזים נקי (Mw 92, 000) מקטלז ריאקציה בקצב של 0. 5 µmol 1 µg (47 של אנזים נקי (Mw 92, 000) מקטלז ריאקציה בקצב של 0.5 µmol.min-1 בתנאים אופטימליים. חשב: א) פעילות ספיציפית ביחידות אנזים למ"ג חלבון. ב) מספר ה- turnover .

E.u. – הינה כמות האנזים שהופכת µmol1 סובסטרט לתוצר בדקה. מכיוון שמדובר על אנזים נקי -

שאלה מס' 47 ב.