Laboratoorne varustus Bioloogilise ohutuse boksid

Bioloogilise ohutuse boks Bioloogilise ohutuse boksid (biological safety cabinets, BSC) on primaarse bioloogilise ohjeldamise vahendid, mis on mõeldud selleks, et kaitsta töötajat, labori sisekeskkonda ja töömaterjale kokkupuutest nakkusohtlike aerosoolidega ja pritsidega, mis võivad tekkida nakkusliku materjali manipuleerimise käigus

Aerosoolide tekke võimalused Aerosooliosakesed moodustatakse igakord, kui vedelikule või poolvedelale materjalile edastatakse energia: raputamine, valamine, segamine, tilgutamine kõvale pinnale või teise vedeliku pinnale Teised aerosooli tekitavad tegevused: kultuuride inokuleerimine pipeti abil, nakkusohtliku materjali pipeteerimine, suspendeerimine, homogeniseerimine, vorteksimine ja tsentriguufimine Selle tegevuse tulemusena tekkinud aerosooliosakesed (< 5 μm diameertris) ja väikesed tilgad (5-100 μm) pole palja silmaga nähtavad Laboritöötaja üldjuhul ei anna endale aru, et tekitab töökäigus aerosoole, mida ta võib sisse hingata või kontamineerida tööpindu või materjale

HEPA filter HEPA – high efficiency particulate air Filter koosneb erinevast materjalist peenikestest klaaskiududest kootud riidest, mis on mitmekordselt volditud pindala suurendamiseks Filtri jääb kinni 99.97% 0.3 μm diameetri suuruseid partikleid S.t. et väljuvad õhku võib vaadelda kui steriilset

HEPA filter poksiiruste virionid on u 0.3 μm diameetris enamus RNA-genoomseid viiruseid omavad viiruspartikleid diameetrig 30-100 nm Mikroorganismid levivad tahkete või vedelate osakeste koosseisus, mille diameeter ületab 0.3 μm

HEPA filter <0.3 μm partiklid NB! HEPA filtrid ei ole võimelised kinni püüdma gaase ja auru!

Bioohutuse bokside klassid Klassideks jagunemise alused boksist väljuva ja boksi tööpinnale siseneva ja õhu filtreerimine väljuva õhu äravoolu ühendus ventilatsiooni süsteemiga Bioohutuse bokside klassid: Klass I – annab aerosoolikaitset laboritöötajale ja vahetu laboriümrusele. Klass II – tagab peale töötaja ja ümbruskonna veel materjali ennast võimalikust kontaminatsioonist. Klass III – kõrgeima kaitseastmega bioohutuse boks, mis tagab maksimaalset kaitset nii töötajale, materjalile, kui ka vahetu ümbruskonnale ja keskkonnale.

Klass I bioohutuse boks Õhu tõmbekiirus 0.38 m/sek Õhk võib väljuda: ruumi sisse ventilatsioonisüsteemi otse hoonest välja

Klass I bioohutuse boks Kasutamisalad: üldine mikrobioloogiline töö madala riskiga mikroorganismidega töötamine igat sorti mikseritega ja blenderitega kui eesava on kinnine ning on jäetud vaid väikesed aknad käte jaoks, mis oluliselt kiirendab õhukiirust, siis võib töötada toksiliste või radioaktiivsete ainetega I klassi bioohutuse boksid ei taga materjali kaitset!

Klass II bioloogilise ohutuse boks erinevad klass I boksidest selle poolest, et boksi tööpinnale sattuv õhk on HEPA filtreeritud, mis on steriilsuse ekvivalendiks eristatakse 4 tüüpi: A, B1, B2 ja B3 õhk väljutatakse kas sama ruumi sisse (A-tüüp) või hoonest välja (B-tüüp) kasutatakse töötamiseks riskigrupi 2 ja 3 mikroorganismidega võib kasutada ka 4 riskigrupi mikroorganismide puhul juhul, kui tegemist on skafander-tüüpi laboriga (positiivse siserõhuga kostüümid)

Klass II tüüp A bioohutuse boks Schematic representation of a Class IIA1 biological safety cabinet. A – eesava B – kaas C – väljuva õhu HEPA filter D – tagumine õhutee E – siseneva õhu filter F – puhur Õhukiirus 0.38 m/s

Klass II tüüp B bioohutuse boksid (B1, B2, B3) On tüüp A variandid Igat varianti kasutatakse vastavalt tööeesmärkidele Erinevad üksteisest järgmistes punktides: õhu sissetõmbekiirus läbi eesava tööpinnale retsirkuleeritud ja boksist väljuva õhu kogus väljutamissüsteem: kas õhk väljub otse hoonest välja, või läbi hoone ventilatsioonisüsteemi negatiivse rõhu teede või käikude olemasolu kontamineeritud õhu jaoks

Klass II tüüp B2 bioohutuse boks Schematic representation of a Class IIB1 biological safety cabinet. A – eesava B – kaas C – väljuva õhu HEPA filter D – siseneva õhu HEPA filter E – väljuva õhu negatiivse rõhuga käik F – puhur G - siseneva õhu HEPA filter Vajalik ühendus hoone ventilatsiooni väljutussüsteemiga.

Klass I ja II bokside kasutamise reeglid boksi töötamisel ei tohi kiiresti liikuda boksi lähedal uste avamine ja sulgemine võib oluliselt mõjutada õhukardina kiirust (s.t. vähendada operaatori kaitset) sama efekti avaldab töötaja käte sagedane ja kiire sisse-välja liigutamine boksi sees asjade asetamine õhu tõmbeavadele OLULISELT vähendab õhu liikumise kiirust boksi sees See tähendab, et ideaalis peavad klass I ja II bioloogilise ohutuse boksid asuma ruumides ustest ning sagedase inimeste liikumisteedest kaugel

Klass III bioloogilise ohutuse boks teine nimetus – ”kinnas-boks” tagavad personali ja keskkonna maksimaalset kaitset riskigrupp 4 mikroorganismide käsitlemiseks kõik boksi seina läbivad torud on hermeetiliselt kinni eesaken ei käi lahti sisenev õhk on HEPA filtreeritud väljuv õhk filtreeritakse topelt boksi sisekeskkond on pidevalt negatiivse rõhu all (u. 124.5 Pa) boksi sisse pääseb ainult läbi kõvast kummist tehtud kinnaste boks on ühenduses kas kahe avaga autoklaaviga

Klass III bioloogiise ohutuse boks (“kinnas-boks”) A – kogu käe pikkusega kinnastega avad käte jaoks B – kaas C – topelt HEPA filter väljuva õhu jaoks D – siseneva õhu HEPA filter E – kahe uksega autoklaav või lüüs F – kemikaalide kogumisnõu Vajalik kõva ühendus iseseisva hoonest õhu väljutussüsteemiga.

Positiivse rõhuga skafandrid Tagavad personali kaitset, mis on ekvivalentne klass III bioohutuse boksi poolt tagavale kaitsele Kostüümid on seest ventileeritavad ning omavad omaette õhuvarustussüsteemi Positiivne sisemine rõhk skafandris ei võimalda aerosoolidel liikuda sisse, kaitstes seega töötajat kokkupuutest nakkusallikaga Võimaldavad töötegemist 3 ja 4 riskigruppi kuuluvate mikroorganismidega, kasutades klass I ja II bokse

Positiivse rõhuga skafandrid

Bioloogilise ohutuse boksi valik Vajav kaitse Bioohutuse boksi valik Personali kaitse, mikroorganismide riskigrupid 1, 2, 3 Klass I, klass II, klass III Personali kaitse, mikroorganismide riskigrupp 4 kinnas-boksidega laboris Klass III Personali kaitse, mikroorganismide riskigrupp 4 skafander-laboris Klass I, klass II Materjali kaitse Klass II, klass III Lenduvad kemikaalid, radioaktiivsed ained – väikesed kogused. Materjali kaitse Klass IIB2, klass IIB1 Lenduvad kemikaalid, radioaktiivsed ained Klass I, klass IIB3, klass III

Laminaarse õhuvoolu boksid (laminar flow fume hood, “puhta õhu boksid”) NB! Vertikaalse ja horisontaalse väljavoolu tööboksid ei kuulu bioohutuse bokside hulka ning neid ei tohi kasutada selle eesmärgiga! Horisontaalse õhuvooluga laminar: HEPA-filtreeritud õhk suunatakse tööpinna mööda otse töötaja poole kasutatakse ainult materjali kaitse eesmärkidega, näiteks ”puhaste” tööde jaoks, nagu steriilse varustuse või elektrooniliste seadmete kokkupanek tolmu-vabades tingimustes Ei tohi kasutada töötatatel, kellel esineb ülitundlikkus käsitletava materjali koostisosade suhtes

Laminaarse õhuvoolu boksid Vertikaalse õhuvooluga laminar HEPA-filtreeritud õhk suundub boksi sees ülevlt alla ning väljub samuti läbi eesava kaane alt suunaga töötaja poole kasutatakse meditsiinis näiteks veenisiseste ravimite valmistamiseks

Desinfitseerimine ja steriliseerimine

Spetsiifilised dekontaminatsiooni nõuded sõltuvad eksperimentaalse töö ja käsitletavate nakkuslike mikroorganismide iseloomust Erinevatel mikroorganismidel on erinev tundlikkus desinfitseerivate ainete suhtes Arvestades desinfitseerivate ainete ning nende tootja firmade rohkust, ei ole võimalik paika panna ühiseid desinfitserimise ja steriliseerimise reegleid Seetõttu, konkreetsed meetodid peaksid olema välja töötatud ja vastu võetud igas laboris eraldi, võttes arvesse konkreetse kasutatava aine tootja soovitusi

Definitsioonid Antimikroobne aine – aine, mis tapab mikroorganisme või pärssib nende kasvu ja paljunemist Antiseptik – aine, mis inhibeerib mikroorganismide kasvu ja arengut ilma neid kohustuslikult tapmata. Üldjuhul kasutatakse antiseptikuid naha desinfitseerimiseks Biotsiid – üldine termin iga aine jaoks, mis tapab mikroorganisme Keemiline germitsiid – kemikaal või kemikaalide segu, mida kasutatakse mikroorganismide tapmiseks

Definitsioonid Dekontamineerimine – mikroorganismide eemaldamise ja/või tapmise protsess. Sama terminit kasutatakse ka ohtlike kemikaalide ja radioktiivsete materjalide puhul Desinfektant – kemikaal või kemikaalide segu, mida kasutatakse mikroorganismide, kuid mitte nende eoste tapmiseks. Desinfektante üldjuhul kasutatakse mitteelusate objektide ja pindade töötlemiseks Desinfektsioon – keemilised või füüsilised meetmed mikroorganismide, kuid mitte nende sporide tapmiseks Sporotsiid – kemikaal või kemikaalide segu, mida kasutatakse mikroorganismide ja nende eoste tapmiseks Steriliseerimine – mikroorganismide ja nende eoste tapmise protsess

Laboratoorsete materjalide puhastamine Puhastamine on mustuse, orgaaniliste jääkide ja värvide eemaldamine Puhastamine tähendab harjamist, vaakuum-aspiratsiooni, pesemist või detergendiga leotamist Mustus, pori ja orgaaniline materjal võivad segada dekontamineerivate ainete toimet Eelpuhastamine on hädavajalik desinfektsiooni ja sterilisatsiooni läbiviimiseks Puhastamise protseduuri teostatakse, vältides nakkusohtliku materjaliga kokkupuudet Üldjuhul kasutatakse eelpuhastamise ja desinfektsiooni jaoks ühte ja sama germitsiidi.

Keemilised germitsiidid - on kemikaalid või kemikaalide segu, mida kasutatakse mikroorganismide tapmiseks Arvestades pidevalt suurenevat kommertsiaalselt saadavate ainete hulka, tuleb hoolikalt kontrollida nende valikut laboris kasutamise jaoks Üldjuhul on gemitsiidne aktiivsus kiirem ja parem kõrgemate temperatuuride juures Samas, kõrge temperatuur soodustab nende aurumist ja lagunemist Paljud germitsiidid on ohtlikud inimesele ja keskkonnale Laboris kasutatavate germitsiidsete kemikaalide hulk peab olema minimaalne, eeskätt keskkonna saastuse tõttu.

Desinfektantide aktiivsused Phenol compounds Hypochlorites Alcohols Formaldehyde Glutaral Iodophors Fungi good slight nil Bacteria (gram +/-) Mycobacteria fair Spores good (<40ºC) good (<20ºC) Lipid Viruses Non-Lipid Viruses variable

Kloori sisaldavad lahused tugevatoimeline oksüdant kasutatakse laia spektriga germitsiidse vahendina tugevalt aluselised, tugevate söövitavate omadustega aktiivsus langeb oluliselt orgaanilise materjali, eelkõige valgu, juuresolekul, seetõttu töölahuse kontsentratsioon, vahetamise režiim sõltuvad desinfitseeritava materjali iseloomust ja kogusest Kontsentratsioon arvutatakse aktiivse kloori järgi (üldjuhul 0.1%), “mustade” tingimuste puhul 0.5% Kõrged kontsentratsioonid võivad söövitada metalle, pleegitada riideid Kasutatakse laialdaselt pindade, instrumentide ja vedelate materjalide dekontamineerimiseks Gaasiline kloor on väga toksiline! Säilitada hästi ventileeritavates ruumides

Kloori sisaldavate germitsiidide lahused „Puhtad“ tingimused „Mustad“ tingimused Aktiivse kloori kontsentratsioon 0.1% (1 g/l) 0.5% (5 g/l) Naatrium hüpokloriit (5% aktiivset kloori) 20 ml/l 100 ml/l Kaltsium hüpokloriit (70% aktiivset kloori) 1.4 g/l 7 g/l Klooramiin (25% aktiivset kloori) 20 g/l Erakorralistes või välitingimustes naatrium hüpokloriiti võib kasutada joogivee desinfitseerimiseks lõppkontsentratsiooniga 1-2 mg/l aktiivset kloori

Formaldehüüd (HCHO) Gaas, mis on võimeline ära tapma kõiki mikroorganisme ja nende eoseid temperatuuril alla 20°C, kuid ei oma aktiivsust prionite vastu. Mõju on suhteliselt aeglane ning vajab toimimiseks vähemalt 70% niiskust Kättesaadav paraformaldehüüdi (tahke) või formaliini kujul (37% formaldehüüdi vesilahus). Soojendamisel eraldub formaldehüüd, mida kasutataksegi dekontaminatsiooni ja desinfektsiooni eesmärkidega suletud ruumides, nt. bioloogilise ohutuse boksides 5% formaliini vesilahust võib kasutada vedela desinfektandina. NB! Formaldehüüd on toksiline kantserogeensete omadustega gaas. Säilitada hästi ventileeritavad ruumis või tõmbekapi all

Fenooli ühendid Ajalooliselt hakati esimestena kasutama keemiliste germitsiididena Kasutatakse bakterite ja ümbrisega viiruste hävitamiseks, kuid ei oma aktiivsust eoste ja ümbriseta viiruste vastu Ei ole tundlik orgaanilise saastuse suhtes Kasutatakse laboris ülddekontamineerimiseks (pinnad, põrand, seinad) ja ka antiseptikutena (nt. triklosaan ja klooroksülenool) Fenooli sisaldavaid vahendeid ei tohi kasutada kohtadel, mis puutuvad kokku toiduga ning lasteasutustes

Kvaternaarset ammooniumit sisaldavad ained Positiivselt laetud (katioonid) pindaktiivsed ühendid Omavad aktiivsust bakterite ja lipiidse ümbrisega viiruste vastu Kasutatakse laialdaselt desinfitseerivates vahendites segudena ning sageli ka kombinatsioonis teiste germitsiididega, nt. alkoholidega Ei ole soovitav kasutada ülddesinfektantidena kitsa antibakteriaalse spektri tõttu Mõned kvaternaarse ammooniumi ühendeid (nt. bensalkoonium kloriidi) kasutatakse antiseptikutena Orgaaniline saastus, kare vesi ja anioonsed detergendid tugevasti alandavad germitsiidset aktiivsust Omavad väga aeglast biodegradeerimise kiirust, mistõttu võivad akumuleeruda keskkonnas

Alkoholid Etanool (etüülalkohol, C2H5OH) ja 2-propanool (isopropüülalkohol, (CH3)2CHOH) omavad sarnaseid desinfitseerivaid omadusi Aktiivsed bakterite, seente ja lipiidset ümbrist omavate viiruste, paljude ümbriseta viiruste vastu, kuid mitte eoste vastu Kõrgeim aktiivsus kontsentratsioonil 70% vees Ei jäta mingeid jälge peale töötlemist 70% alkoholi vesilahust kasutatakse laialdaselt laboris ja meditsiinis naha ja labori tööpindade desinfitseerimiseks

Jood ja joodofoorid Toime on sarnane kloori toimega Vähem tundlikud orgaanilise saastuse suhtes Ei ole ta kasutatav ülddesinfektandina värvi tõttu Kasutatakse antiseptikutena naha ja limaskestade desinfitseerimiseks

Vesinikperoksiid ja ülihapendid Väga tugevad oküdandid ning seetõttu laia spektriga germitsiidid Ohutumad inimesele ja keskkonnale, kui kloori ühendid Desinfitseerimiseks kasutatakse 3-6% lahust tööpindade, meditsiiniliste instrumentide dekontamineerimiseks Vesinikperoksiidi ja peratsetaadi (CH3COOOH) auru kasutatakse bioohutuse bokside, meditsiiniliste seadmete ja ruumide dekontamineerimiseks Võivad söövitada metalle (alumiiniumit, vaske, pronksi, zinki) ja pleegitada riiet, juukseid, nahka ja limaskestasid

Laboriruumide dekontamineerimine Pinnad – naatrium hüpokloriit 0.1% vaba klooriga üldkoristuse puhul ning 0.5% vaba klooriga – riskisituatsioonide puhul Alternatiiviks on 3% vesinikperoksiidi lahus Ruumid tervikuna ja seadmed – fumigeerimine (suitsutus) formaldehüüdi gaasiga kas kuumutades pereformaldehüüdi või keetes formaliini. Peale protseduuri lõpetamist ruume ventileerida. Vajadusel kasutada formaldehüüdi neutraliseerimiseks gaasilist ammooniumbikarbonaati. Väiksemate ruumide jaoks sobib fumigeerimine vesinikperoksiidi auruga

Bioloogilise ohutusbokside dekontamineerimine 1. Formaldehüüdiga Tahke paraformaldehüüdi kuumitamisel boksi sees eraldub formaldehüüd (6 tundi) 70% niiskuse tagamiseks – kuuma vee anum Toimeaine äraaurumisel neutraliseeritakse formaldehüüd ammooniumbikarbonaadiga (u. 1 tund) Enne töö alustamist pühitakse boksi pinnad formaldehüüdijääkide eemaldamiseks 2. Vesinikperoksiidiga Kasutatakse vesinikperoksiidi auru Kiirem ja mugavam, kuid nõuab spetsiaalset aparatuuri Absoluutseks eeliseks on see, et vesinikperoksiid laguneb jäljetult ära

Käte pesemine/dekontamineerimine Kinnaste kandmine ei tühista regulaarse käte pesemise vajadust! Käsi pestakse pärast töötamist bioloogiliselt ohtliku materjaliga või loomadega ning enne laborist lahkumist Enamus situatsioonides on käte pesemine tavalise seebi ja veega täiesti piisav dekontamineerimiseks Risk-situatsioonides kasutatakse germitsiidseid seepe Desinfitseerimiseks kasutatakse 70% alkoholi või selle sisaldavad kätegeelid 70% alkoholi võib kasutada käte desinfitseerimiseks ka juhtudel, kui käte pesemine ei ole kättesaav

Kuum desinfitseerimine ja steriliseerimine Keetmine – kahtlane, ei tapa kõiki mikroorganisme, kasutatakse teiste võimaluste puudumisel “Kuiv kuumus - 160C ja kõrgem 2-4 tunni jooksul, kasutatakse metalinstrumentide puhul (ei põhjusta korrosiooni) „Märg“ kuumus - autoklaavimine Põletamine – efektiivseim viis hävitamiseks

Autoklaavimine Küllastatud aur rõhu all on kõige efektiivsem ja usaldusväärsem meetod laboratoorse materjali steriliseerimiseks (ja ka kõige odavam) Küllastatud aur – aur, mis on vastavalt oma rõhule vedeliku keemistemperatuuril. Rõhu kasvades vedelike keemistemperatuur tõuseb Enamus juhtudel sterilisatsiooni tagavad järgmised autoklaavimise tsüklid: 3 min - 134 °C 10 min - 126 °C 15 min - 121 °C 25 min - 115 °C

Autoklaav Charles Chamberland 1879

Autoklaav

Autoklaavi kasutamine Autoklaaviga peab töötama ainult vastavat väljaõpet saanud kogenud laboripersonal! Materjalid peavad olema pakitud vabalt, et kindlustada auru kerget läbimist kambri sees. Pudelid, kotid ja biksid peavad olema pool-lahti Tsükli käivitamisel lisada materjali juurde panna indikaator Temperatuuri indikaatorid: Keemilised: valged triibud valgel teibil muutuvad pruuniks kõrgel temperatuuril Bioloogilised: sisaldavad temperatuuri-resistentse bakteri Geobacillus stearothermophilus’e eoseid. Kui autoklaav pole saavutanud õiget temperatuuri, siis eosed lähevad kasvama, muutes uuresoleva pH indikaatori värvi Füüsilised: koosnevad metallide sulamist, mis sulab ainult peale inkubeerimist 121°C juures vähemalt 15 minutit

Põletamine/tuhsatamine Nakkusohtliku labratoorse materjali põletamine on autoklaavimise alternatiiviks Kasutatakse näiteks anatoomiliste jäätmete ja teiste jäätmete hävitamiseks kas elneva dedkontamineerimisega või ilma Põletites peaks olema tagatud temperatuur 1000°C, et vältida ohtlike mikroorganismide sattumist atmosfääri koos väljutava õhuga