גידול תרביות תאים למטרות רפואיות 3 הכנת שתלי עור, הנדסת רקמות , ריפוי גני אבחון איכותי וכמותי של זיהום נגיפי בתאים אבחון גנטי גילוי פגם גנטי בעובר ע"י הכנת תרבית אפידרמיס המשמשת שתל לשחזור עור באזור פציעה או למטרות של ריפוי גני ע"י הכנת תרבית חד-שכבתית של תאים מרקמה החשודה לנוכחות נגיף או ע"י הוספת נוזל גוף של חשוד במחלה ע"י הכנת תרבית חד-שכבתית של תאי עור העובר, ממי שפיר בחודש חמישי ובדיקת כרומוזומים. http://www.invitrobiotec.de/3d_gewebe_e.htm צילום במיקרוסקופ אלקטרוני של נגיפים מסוג אדנו בתוך רקמת כבד של בע"ח http://www.vet.uga.edu/IVCVM/1998/steffens/steffens.htm 37

תרבית ראשונית של תאי לב עובריים של חולדה העשרה דוגמה לגידול תרבית תאים למטרת מחקר רפואי תרבית ראשונית של תאי לב עובריים של חולדה Primary cultures of E15 embryonic rat hearts grown on Fibronectin for 6 days beat in a spontaneous and synchronous fashion. Cardiac myocytes in these cultures proliferate in vitro and serve as a model to study the molecular mechanisms that regulate their cell cycle. http://dba.med.sc.edu/GOODWIN/LAB/pulse.htm 38

דוגמה לשימוש בתרבית תאים לאבחון זיהום נגיפי בדגימה חשודה העשרה דוגמה לשימוש בתרבית תאים לאבחון זיהום נגיפי בדגימה חשודה רובד תאים בריא לא מודבק בנגיף (ביקורת ) התאים בריאים וצורתם תקינה רובד תאים שנפגע ע"י נגיף שהיה בדגימה הנבדקת התאים נהרסו – יש אפקט ציטופתי Monolayer of normal uninfected cells Monolayer of cells showing viral cytopathic effect נגיפים במיקרוסקופ אלקטרוני צביעה חיובית בנוגדן מונוקלונלי פלואורסצנטי ספציפי לנגיף The aim of this section is primarily educational. It informs you about virus diagnostics, 39 מידע פרסומי של חברה מסחרית http://www.clinical-virology.org/pages/cvn/sp_gp/cvn_gp_how.html

הכנת שתל עור בתרבית 40 אפידרמיס אפידרמיס 1. מפרידים פיסת אפידרמיס של עור אדם מהדרמיס פירוק אנזימי של הרקמה עם טריפסין עור שלם 2. מקבלים תרחיף תאי אפידרמיס בודדים , אותם זורעים על שכבת פיברובלסטים מוקרנים ב UV , המשמשים שכבה מזינה בתרבית תרחיף תאי אפידרמיס של עור אדם 3. א. אחוז קטן מסה"כ התאים ( 10% ) הם תאים בעלי יכולת התחלקות . הם מתרבים ויוצרים מושבות על השכבה המזינה של הפיברובלסטים. תאי האפידרמיס אוספים את המושבות ושוב מפרידים לתאים בודדים עם טריפסין פיברובלסטים מוקרנים (שכבה מזינה) 3. ב. מעבירים לכלי גידול חדש להמשך התרבות. עכשיו , 70% מהתאים הם בעלי יכולת התרבות ונקבל מושבות נוספות על השכבה המזינה. לאחר 7-9 ימים קורנוציטים (שכבה קרנית של תאים מתים) 4. נוצרת שכבת אפיתל רציפה (תאים המחוברים ביניהם ע"י דסמוזומים) מוציאים ומרחיקים את שכבת הפיברובלסטים. במרכז שכבת האפיתל מתחילה התמיינות תאים לקראטינוציטים ומתקבל מבנה רקמתי רב-שכבתי כמו בעור . - בתחתית יש שכבת בסיס של תאים מתחלקים - בשכבה העליונה יש תאים ממוינים ( קראטינוציטים ) קרטינוציטים ממוינים ( שכבת אפיתל ) שכבת בסיס (תאי אפידרמיס מתחלקים ) מוציאים שכבת פיברובלסטים 40

בתרבית , אנחנו מגדלים את האפידרמיס בלבד , החלק שנמצא מעל הדרמיס שכבת קרטינוציטים 5. הקראטינוציטים יוצרים משטח שתל עור בתרבית . מנתקים את שתל האפיתל מהתרבית ע"י אנזים ונזהרים לא לפגוע בדסמוזומים. שוטפים את השתל ובודקים אותו לנוכחות גורמים מזהמים מזיקים .ניתן להקפיא עד לשימוש או להשתמש בו מידית. 6. השתלת השתל ותהליך קליטתו באזור הפצע כעבור שבוע לאחר ההשתלה : ממברנת היסוד מתחילה להיווצר,מתחת לאפידרמיס, ומופיעים תאים מסוג מלנוציטים במגע עם האוויר נוצרים קורנוציטים הבונים את השכבה הקרנית החיצונית של העור . כעבור חודש : ממברנת היסוד מושלמת – ויש הפרדה בין האפידרמיס לדרמיס יש חיבור לכלי הדם. נימי דם מתחילים להזין את האפידרמיס כעבור שנה : השכבה הבסיסית מתעבה ומקבלת קימוטים להגמשת העור באזור השתל. כעבור 5 שנים: השתל מתאחה עם העור בצורה מושלמת ומקבל מבנה טבעי של העור . בתרבית , אנחנו מגדלים את האפידרמיס בלבד , החלק שנמצא מעל הדרמיס אפידרמיס טבעי אפידרמיס מתורבת http://www.med.monash.edu.au/surgery/alfred/research/tissue-culture.html 41

הסיבות להצלחת הכנת שתלי עור בתרבית יתרונות תאי העור והשיטה התאים יציבים ומתרבים מהר יחסית בתרבית מקבלים כמויות גדולות של עור מתורבת יש זהות אנטיגנית לעור המקורי ואין סכנת לדחייה חיסונית אין פגיעה חודרנית בחולה הקושי בהשתלת עור מתורבת : הופעת זיהום מיקרוביאלי באזור הכוויה ( נפוץ ) המקטין את יכולת קליטת השתל במקום שימושים של שתלי עור: שתלי עור משמשים בשחזור עור. לרוב במקרים של כוויות . השתל נקלט ומשתרש באזור הפצע. הוא ניזון מכלי הדם באזור. במהלך קליטת השתל מתרחשים שינויים ביוכימיים-מבניים בהרכב ובארגון התאים בשתל ומתקבל מבנה טבעי של אפידרמיס. שתלי עור משמשים אמצעי בריפוי גני ( ראה נושא ריפוי גני ) 42

העשרה מבנה העור שכבה קרנית = מספר שכבות של קורנוציטים (תאים קרטינוציטים מתים ויבשים נמצאת מעל האפידרמיס להגנה מפני חדירת מים ופגיעות מכאניות . אפידרמיס = אפיתל רב-שכבתי המורכב מהרבה שכבות של תאים קראטינוציטים ( יוצרי חלבון סיבי קראטין) המחוברים ביניהם בשלוחות דסמוזומים. באפידרמיס יש גם תאים מלנוציטים (יוצרי פיגמנט מלנין ). חלקו העליון = שכבות של תאים חיים שעברו התמיינות ל תאי קראטין ( קרטינוציטים ) חלקו התחתון = שכבה בסיסית של תאים מתחלקים הנדחפים כלפי מעלה. בדרכם מתמיינים לקרטינוציטים ממברנת יסוד = מפרידה בין האפידרמיס לדרמיס מתחתיו דרמיס = רקמת חיבור של שכבת תאים פיברובלסטים ( יוצרי קולגן ואלסטין – חלבוני מבנה חוץ תאיים) בדרמיס יש גם זקיקי שערות , בלוטות זיעה, בלוטות שומן, נימי דם . הדרמיס מזין את האפידרמיס ,ע"י דיפוזיה , במרכיבי מזון המגיעים מהדם והן בגורמי גידול והתרבות המופרשים ע"י הפיברובלסטים . 43 http://autoimmune.pathology.jhmi.edu/diseases.cfm?systemid=10

איור מפורט של מבנה העור העשרה 44 http://pathology.mc.duke.edu/research/PTH225.html http://www.geneve.ca/about_skin.html http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/imagepages/8912.htm 44

הנדסת רקמות ופיתוח חלקי חילוף לגוף האדם העשרה הנדסת רקמות ופיתוח חלקי חילוף לגוף האדם הכנת שתל לבלב מלאכותי בתוך נשא פלסטי להשתלה בגוף חולה סוכרת תאי לבלב בריאים המייצרים אינסולין נלקחים מתורם בריא מגדלים ומרבים את התאים בתרבית בתוך נשא פלסטי ספוגי משתילים מתחת לעור או בחלל הבטן את הנשא הפלסטי עם תאי הלבלב הכלואים בתוכו. הנשא מפריש אינסולין המיוצר ע"י תאי הלבלב הכלואים בתוכו ומוזרם לזרם הדם הנשא מגן על התאים של התורם מפני דחייה חיסונית כי תאי החיסון לא יכולים לחדור לתוכו גידול אוזן אדם על עכבר http://www.betterhumans.com/Wiki/tabid/54/Default.aspx 45

העשרה עיקרון הנדסת רקמות http://www.ptei.org/camp/main-default.html 46

הרקמות הנמצאות כיום בפיתוח ע"י הנדסת רקמות ולהכנת חלקי חילוף העשרה הרקמות הנמצאות כיום בפיתוח ע"י הנדסת רקמות ולהכנת חלקי חילוף http://www2.mahidol.ac.th/spectrum/page3_vol10_no3.htm http://www.tissueeng.net/main.htm 47

תרבית תאי גזע עובריים העשרה 48 תרבית תאי גזע עובריים http://www.accessexcellence.com/WN/SU/stem1198.html 48

אנימציה של התפתחות ביצית מופרית והפקת תאי גזע (stem cells) בתרבית העשרה אנימציה של התפתחות ביצית מופרית והפקת תאי גזע (stem cells) בתרבית Animation http://www.accessexcellence.com/WN/SU/stem1198.html 49

סיכום תחומי המחקר בתרבית תאים ראשונית העשרה סיכום תחומי המחקר בתרבית תאים ראשונית Species-specific primary cell cultures : a research tool in veterinary science http://www.vetscite.org/gfx/08_00/fig1_sultan.gif 50