14. Biljne membrane 14.1. Uvod u strukturu membrana 14.2. Funkcionalni aspekti biljnih membrana 14.3. Aspekti spoljašnje sredine membrana sa posebnim osvrtom na temperaturu 14.4. Izolovanje organela i 14.5. Herbicidi koji utiču na metabolizam membran- skih lipida

14.1. Uvod u strukturu membrana The cell membrane, also called the plasma membrane or plasmalemma and cell surface membrane, is a selectively permeable lipid bilayer which comprises the outer layer of a cell. Osnovna struktura biljnih membrana koja je i danas opšte priznata je ona koju su predložili Singer i Nicholson, a to je struktura po “fluidno-mozaičnom” modelu. “Fluidno mozaični” model predočava da osnovnu strukturu membrane čini lipidni dvosloj u kojem proteini mogu biti ugradjeni, uronjeni ili pridodati na spoljašnju površinu membrane (slika 14-1). Slika 14-1. Uprošćen prikaz fluidno mozaične strukture membrane

Slika 14-1. Uprošćen prikaz fluidno mozaične strukture membrane Slika 14-1. Uprošćen prikaz fluidno mozaične strukture membrane. Lipidni dvosloj (čije su glavne komponente fosfogliceridi ili u hloroplastima glikozilgliceridi) čini kičmu membranske strukture. Acil-lanci su iznad njihove Tt (¨tranziciona temperatura¨, tj. temperatura prelaska iz jednog u drugo agregatno stanje), i stoga su fluidni u normalnoj funkcionalnoj membrani. I, integralni proteini koji premošćuju i povezuju membranu ili, kao I2, proteini samo uronjeni u jednu polovinu dvosloja. Spoljašnji proteini (E) su povezani sa fosfolipidnim dvoslojem jonskim interakcijama

Membrane su fluidne ? Da bi membrana efikasno funkcionisala - smatra se da većina acil-lanaca mora preći iz svog gel stanja na ¨tranzicionoj temperaturi¨ i stoga ona mora biti fluidna. Ovo ima važnu implikaciju na osetljivost i otpornost biljaka prema niskim temperaturama. “Fluidne” membrane su potrebne za efikasnu funkciju membranskih proteina i to ne samo zbog omogućavanja odgovarajuće pokretlji-vosti supstrata i proizvoda do enzima, već i da bi omogućile bočnu pokretljivost proteina potrebnih u transportu, elektron-transportu i akumulaciji fotona (kvanata sunčeve svetlosti). Zbog toga proteini transportnog sistema koji deluju kroz mehanizam otvaranja pora moraju da se podvrgnu konformacionim promenama, dok oni koji imaju ulogu nosača moraju da prodju kroz hidrofobnu unutrašnjost dvosloja.

14.2. Funkcionalni aspekti biljnih membrana Mnoga svojstva membrana u svim eukariotskim organizmima su zajednička: ► Prvo - one predstavljaju propustljive barijere za mnoge molekule čime omogućavaju da se u ćelijama i njihovim organelama kao jedinstvenom okruženju odvijaju metabolički i drugi procesi. S obzirom da su membrane nepropustljive za “velike” molekule, neophodno je prisustvo specifičnih transportnih procesa koji omogućavaju transport ovakvih molekula ukoliko je to potrebno. Najvažnije pitanje u vezi transporta supstanci kroz membrane je da li ovaj proces zahteva trošenje energije od strane ćelije.

U pasivnom transportu - supstance se pokreću iz regiona gde je koncentracija veća, u region gde je ona manja, tj. prenos supstanci je u smeru gradijenta koncentracije. U ovom slučaju ćelija ne troši energiju. U aktivnom transportu - supstance se prenose iz regiona manje koncentracije prema mestu gde je koncentracija veća, tj. suprotno gradijentu koncentracije i tada ovaj proces zahteva trošenje energije od strane ćelije. Pasivni transport - se deli u dve kategorije: ♦ prosta difuzija i ♦ olakšana difuzija Kod proste difuzije - molekul se kreće direktno kroz otvor ili poru na membrani bez interakcije sa drugim molekulom. (slika 14-5). Olakšana difuzija - uključuje prisustvo proteina nosača. Molekul koji se transportuje kroz membranu vezuje se za protein nosač pre nego što samostalno prođe kroz nju.

Slika 14-5. Šematski prikaz proteinskog kanala Slika 14-5. Šematski prikaz proteinskog kanala. Na ovom primeru (desno), proteinski kanal se sastoji iz četiri subjedinice. Kako proteinski kanali, koji imaju ulogu u prostoj difuziji, tako i protein-nosači koji omogućavaju olakšanu difuziju, imaju pore kroz koje supstance mogu prolaziti. Razlika izmedju njih ogleda se u tome što se pri olakšanoj difuziji supstanca koja ulazi u ćeliju vezuje za protein nosač, dok pri prostoj difuziji joni i mali molekuli jednostavno prolaze kroz poru u proteinskom kanalu.

Aktivni transport - podrazumeva kretanje supstance suprotno gradijentu koncentracije, slično pumpanju vode naviše. Tipičan primer je - kretanje jona kalijuma u ćeliju uz simultani izlazak jona natrijuma iz ćelije, nazvan natrijum-kalijumova jonska pumpa. Rad Na-K pumpe je organizovan na način prikazan na slici 14-6.

► Drugo - membrane su mesto za enzime i druge aktivne unutrašnje proteine. Za enzime metabolizma hidrofobnih molekula, kao što su oni koji katalizuju reakcije lipida, unutrašnjost membrane predstavlja odgovarajuću sredinu za njihovu aktivnost. Kod reakcija koje se odvijaju na odredjenoj strani membra-ne, ona omogućuje proteinima da se postave u specifičan položaj u odnosu na jednu ili drugu stranu membrane. Zbog ovoga, fotosintetički kompleksi (PS I, PS II) su u stanju da funkcionišu kroz simultano stvaranje protonskog gradijenta u membrani što je od primarnog značaja za fotofosforilaciju.

► Treće - membrane učestvuju u procesu skladištenja molekula kao i u sekreciji. Membrane uljnih telašaca, su primer za to. Drugi primer kod biljaka su žlezde za izlučivanje soli u lišću Tamarix-a koje omogućuju biljci tolerantnost prema salinitetu. ► I konačno, - membrane mogu posedovati receptore koji služe u prenosu spoljašnih signala. Receptori za auksine i fitohormone su dobro proučeni i oni omogućavaju ovim regulatorima rasta biljaka da vrše svoju funkciju. Kao drugi primer bi se mogla navesti uloga membrana u produkciji sekundarnih mesendžera putem hidrolize fosfatidilinozitol-4,5-difosfata.

14.3. Aspekti spoljašnje sredine... ► Mnogobrojni uticaji spoljašne sredine menjaju sastav i/ili metabolizam lipida u biljkama. Tu se ubrajaju: 1. svetlost, 2. temperatura, 3. polutanti iz atmosfere, 4. soli iz zemljišta, 5. ksenobiotici, kao npr. pesticidi idr. ► Najočigledniji uticaj svetlosti - ogleda se u stimulaciji fotosintetske funkcije membrane. Svetlost je neophodna za razvoj hloroplasta, i iz tog razloga dolazi do značajnih promena u sastavu lipida u lišću. Najvažniju promenu čini produkcija hlorofila tj. ozelenjavanje lišća, ali se pri tome i sastav acil-lipida menja (tabela 14-1). Najistaknutiji primeri za ovo su povećanje sadržaja -linolenata i pojava trans-3-heksadekenoata.

Tabela 14-1. Promena u sastavu masnih kiselina u tkivu pasulja u uslovima rasta na svetlu i mraku. Masne kiseline (%) 16:0 16:1a 18:0 18:1 18:2 18:3 Druge Svetlo 12 7 3 3 14 56 5 Mrak 17 1 5 2 34 39 2 a/ 4% kao trans-3-heksadekenoat koji nije prisutan u mraku Svetlost stimuliše kako proces fotosinteze, a kroz to i produkciju ATP i NADPH, tako i sintezu masnih kiselina i lipida. Acetil-CoA-karboksilaza se aktivira, najverovatnije zbog promena u stromama (tabela 14-2). Merenje sinteze masnih kiselina pomoću radioaktivnih prekursora je pokazalo da je nastajanje lipida u lišću oko 20 puta brže na svetlosti nego u mraku.

Tabela 14-2. Mogući putevi stimulacije hloroplastne acetil-CoA- karboksilaze pomoću svetlosti. In vivo izmene za Izmena aktivnosti Parametri vreme fotosinteze in vitroa Povećanje aktivnosti Od Do Od Do pH 7.1 8.0 50 155 3.1x Mg2+ 2 mM 5 mM 70 165 7.3x ATP 0.5-0.8 mM 0.8-1.4 mM 80 135 12.3x ADP 0.6-1.0 mM 0.3-0.6 mM 65 125 23.6x a/ Aktivnost je izražena kao nmol/min/mg proteina.

► Efekat temperature - sa poljoprivrednog stanovišta, postoji veliko interesovanje za sposobnost odredjenih biljnih vrsta da pokazuju otpornost na niske temperature. Ako bi se neki usev, koji je osetljiv na hladnoću, mogao učiniti otpornim onda bi se postigla i njegova rasprostranjenost na veći broj zemalja uzgoja. Zbog toga biohemičari istražuju mehanizme koji biljkama mogu pomoći u prilagodjavanju niskim temperaturama (0 – 10oC). Postoji veliki broj načina kod kojih promene u sastavu membranskih lipida mogu doprineti nastajanju ''tečnije¨ membrane, ili alternativno, nastajanju dvosloja koji je fluidniji pri nižim spoljašnjim temperaturama (tabeli 14-3).

Tabela 14-3. Načini kojima se promenom u sastavu lipida izazivaju promena u fluidnosti membrana kod biljaka. 1. Remodelovanjem molekulskih vrsta MK, 2. Izmena u nezasićenosti MK, 3. Promenom u odnosima klasa lipida, 4. Smanjenjem odnosa lipida i proteina pri niskim temperaturama itd.

1. Remodelovanje molekulskih vrsta - može obuhvatati ili sveukupno stvaranje novih kombinacija masnih kiselina (slika 14-7), ili zamenu mesta dve postojeće kiseline u molekulu glicerola (slika 14-8). Kako u ovom slučaju nove masne kiseline ne moraju da se sintetizuju, ova promena se često smatra hitnim odgovorom u nuždi izazvanim iznenadnim sniženjem spoljne temperature. Slika 14-8. Slika 14-7.

Biljke osetljive na %a Biljke otporne na % hladnoću hladnoću Kada biljka sadrži više od 20% ukupnih tilakoidnih fosfatidilglicerola u obliku dipalmitoil-(Tt=42oC) ili 1-palmitoil, 2-trans-3-heksadekenoil kombinaciji (Tt=32o C) onda se smatra da je ona podložna oštećenju izazvanim mržnjenjem (tabela 14-4). Tabela 14-4. Korelacija različitih biljaka osetljivih na hladnoću sa sadržajem 16:0/16:0 – i 16:0/trans 16:1 – molekulskih vrsta fosfatidilglicerola. Biljke osetljive na %a Biljke otporne na % hladnoću hladnoću Indijski krompir 65 Salata 17 Bundeva 64 Spanać 6 Pirinač 44 Maslačak 4 Duvan 39 Kupus 4 Kukuruz 37 Pšenica 3 %a (a= vrednosti kao mol; % = ukupni fosfatidilgliceroli).

Biljke, kao npr. bundeva, koja proizvodi velike količine navedenih (¨zasićenih¨) molekulskih vrsta fofatidilglicerola po svoj prilici sadrže enzime glicerol-3-fosfat aciltransferaze koji pokazuju supstratnu specifičnost prema palmitatu, kao i oleatu (slika 14-9). Slika 14-9. Stvaranje nezasićenih vrsta fosfatidilglicerola u biljkama osetljivim na temperaturu zavisno od specifičnosti njihovih glicerol-3-fosfat-aciltransferaza. Put A - je dominantan kod biljaka otpornih na hladnoću i proizvodi visoko fluidne molekule fosfatidil-glicerola.

Veoma česta promena koja se dešava kod membranskih lipida u uslovima sniženja spoljne temperature ogleda se u povećanju nezasićenosti istih. Uvodjenje cis dvostruke veze u zasićeni lanac dovodi do ogromne razlike u njegovoj tački topljenja. Tako stearinska kiselina ima Tt na 58o C dok oleinska ima Tt na 14o C. Uvodjenje druge nezasićene veze snižava dalje tačku topljenja (linolna kiselina, Tt= -5o C) mada ne toliko kao prva dvostruka veza. Zbog toga, povećanje nezasićenosti membranskih lipida pokazuje značaj u smislu adaptivnog odgovora biljaka.

1. Povećanim snabdevanjem supstratom, 2. Aktiviranjem desaturaza i Ovaj mehanizam u kome dolazi do povećanja nezasićenih masnih kiselina u uslovima sniženja spoljne temperature je proučavan u mnogim organizmima. Predložene su tri osnovne teorije (tabela 14-6). Tabela 14-6. Kako sadržaj nezasićenih masnih kiselina može biti povećan na niskim temperaturama ? 1. Povećanim snabdevanjem supstratom, 2. Aktiviranjem desaturaza i 3. Sintezom nove protein-desaturaze (– verovatno povećanom transkripcijom gena).

14.4. Izolovanje organela i membrana Za istraživanje izgradnje i biohemijskih funkcija pojedinih ćelijskih organela, vrlo je važan postupak diferencijalnog centrifugovanja. Ovim se postupkom membranama obavijene čestice mogu međusobno odvojiti i pojedinačno ispitati. Danas uobičajeni postupak prikazan je na slici 14-10. Tako dobivene frakcije, koje se moraju “prečistiti” ponovnim centrifugovanjem, mogu se odvojeno ispitati s’ obzirom na njihov hemijski sastav, sadržaj enzima i njihovo učešće u metabolizmu. Kao merilo čistoće frakcija obično se uzimaju karakteristični enzimi (enzimi markeri). Npr. sukcinat-dehidrogenaza i citohrom-oksidaza nalaze se samo u mitohondrijama.

Slika 14-10. Odvajanje ćelijskih organela diferencijalnim centrifugovanjem.

14.5. Herbicidi koji utiču na metabolizam membranskih lipida Postoje tri osnovne klase herbicida koji imaju primarnu ulogu u izazivanju promena tokom biosinteze membranskih lipida (slika 14-11).

Prvu klasu - čine supstituisani piridazinoni koji deluju u tri osnovna pravca: 1. inhibiraju stvaranje karotenoida, 2. vrše promene u procesu desaturacije masnih kiselina i 3. ometaju proces transporta elektrona. Iz grupe desaturaza masnih kiselina posebno sklona dejstvu herbicida je -15 desaturaza koja prevodi linoleat u -linolenat. Ipak, najveća herbicidna aktivnost mnogih piridazinona ogleda se u inhibiciji sinteze karotena, obično na nivou fitoen-desaturaze. Manjak karotenoida omogućuje obimnu fotodestrukciju hlorofila tokom fotosinteze, a zbog ovog efekta, jedinjenja koja ih izazivaju nazvana su ¨herbicidi za beljenje¨.

Drugu klasu - herbicida čine tiokarbamati (slika 14-11) Drugu klasu - herbicida čine tiokarbamati (slika 14-11). Za mnoga od ovih jedinjenja se zna da remete stvaranje voskova. Tačan mehanizam ovog dejstva se još proučava ali se veruje da se tiokarbamati prevode u svoje sulfoksidne derivate koji u stvari predstavljaju herbicidna jedinjenja. Sulfoksidni derivati tiokarbamatnih herbicida inhibiraju elongaciju masnih kiselina i time sprečavaju nastanak veoma dugačkih lanaca masnih kiselina koje su prekursori mnogih voskova.

Treću klasu - jedinjenja predstavljaju nedavno otkriveni “trava-specifični” herbicidi. Mogu se predstaviti pomoću dve osnovne hemijske strukture: 1. ariloksifenoksipropionatna i 2. cikloheksandionska. Ova jedinjenja deluju inhibitorno na acetil-CoA karboksilazu u osetljivim travama (Poaceae) ali ne i u ostalim monokotiledonim ili dikotiledonim vrstama. Ono što je interesantno je da se mehanizam selektivnosti bazira na razlici u strukturi ciljanog enzima, acetil-CoA karboksilaze, a ne na različitom usvajanju, transportu ili metabolizmu herbicida. Ovo je veoma neobična osnova za selektivnost odredjenog herbicida. Ubrajaju se medju najaktivnije poznate herbicide i pokazuju nisku toksičnost prema drugim organizmima.

Slika 14-11. Osnovne strukture nekih klasa herbicida koji utiču na biosintezu masnih kiselina

Izvod  Osnovna struktura biljnih membrana koja je i danas op{te priznata je ona koju su predlo`ili Singer i Nicholson, a to je struktura po “fluidno-mozai~nom” modelu “Fluidno mozai~ni” model predo~ava da osnovnu strukturu membrane ~ini lipidni dvosloj u kojem proteini mogu biti ugradjeni, uronjeni ili pridodati na spolja{nju povr{inu membrane  Tehnike dubokog zamrzavanja u elektronskoj mikroskopiji, (freeze-fracture i freeze-etching) su otkrile da membrane pokazuju “prostornost” u odnosu na njihove proteine {to navodi da se isto pitanje mo`e postaviti i u odnosu na distribuciju lipida u membranama.  Kada su ove tehnike primenjene i na biljnim membranama, ustanovljen je, kao i kod drugih organizama, bo~ni raspored lipida (slika 14-3). Pretpostavlja se da ovaj bo~ni raspored ima zna~aj u strukturnom pogledu.  Membranski proteini nisu va`ni samo kao strukturni elementi. Mnogi od njih imaju razli~ite biohemijske funkcije kao enzimi, transportni proteini ili receptori. U membrani su asimetri~no raspore|eni.  Mnoga svojstva membrana u svim eukariotskim organizmima su zajedni~ka. Prvo, one predstavljaju propustljive barijere za mnoge molekule ~ime omogu}uju da se u }elijama i njihovim organelama kao jedinstvenom okru`enju odvijaju metaboli~ki i drugi procesi. Drugo, membrane su mesto za enzime i druge aktivne unutra{nje proteine. Tre}e, membrane u~estvuju u procesu skladi{tenja molekula kao i u sekreciji  Mnogobrojni uticaji spolja{ne sredine menjaju sastav i/ili metabolizam lipida u biljkama. Tu se ubrajaju svetlost, temperatura, polutanti iz atmosfere, soli iz zemlji{ta i ksenobiotici, kao npr. pesticidi.  Svetlost stimuli{e kako proces fotosinteze, a kroz to i produkciju ATP i NADH, tako i sintezu masnih kiselina i lipida. Acetil-CoA-karboksilaza se aktivira, najverovatnije zbog promena u stromama (tabela 14-2). Merenje sinteze masnih kiselina uz pomo} radioaktivnih prekursora je pokazalo da je nastajanje lipida u li{}u oko 20 puta br`e na svetlosti nego u mraku.  Biljake otporne na hladno}u proizvode visoko fluidne molekule fosfatidilglicerola.