בחינת יעילות השיטה IgG Avidity test"" לאבחון הדבקה אקוטית בנגיף קדחת מערב הנילוס אליסה קריב פרויקט מחקר במדעי החיים (20567) בהנחיית ד"ר יניב לוסטיג המעבדה לנגיפים זאונוטיים- בית החולים שיבא-תל השומר

West Nile virus - נגיף קדחת מערב הנילוס הנגיף משתייך לסוגFlavivirus ממשפחת ה- .Flavivirida נגיף זאונוטי המסוגל להדביק בני אדם ומינים שונים של בעלי חיים: עופות הנדבקים בנגיף מפתחים רמות וירמיה גבוהות .(amplifier hosts) יתושים הניזונים מדם המכיל כיל גבוה של נגיפים עשויים להידבק בעצמם ואף להדביק בעלי חיים נוספים באמצעות עקיצותיהם. בני אדם ויונקים נוספים הנדבקים בנגיף מפתחים רמות וירמיה נמוכות ואינם מדביקים יתושים הניזונים מדמם (dead-end hosts).

אפידמיולוגיה הנגיף התגלה לראשונה בשנת 1937 במחוז הנילוס המערבי אשר באוגנדה. לאורך המאה ה-20 הופיע לסרוגין באפריקה ואסיה בלבד, ולא נחשב כגורם סיכון מרכזי לבני אדם. התפרצויות נרחבות של הנגיף החלו להופיע באירופה וצפון אמריקה החל משנות ה-90 והביאו למאות מקרי תחלואה ועשרות מקרי מוות. התפרצויות המחלה מתרחשות לרוב בין חודשי הקיץ המאוחרים וחודשי הסתיו המוקדמים. אופייה העונתי של המחלה נובע מתקופות פעילותם של יתושים, המהווים את גורם ההדבקה העיקרי.

גורמי הדבקה מרכזיים גורם עיקרי- עקיצות יתושים שנדבקו בנגיף. יתושים עשויים להידבק כתוצאה מהזנה בדם המכיל ריכוז גבוה של נגיפים (לרוב מעופות) ההדבקה מביאה לרמות וירמיה גבוהות ולהפרשת הנגיף ברוק היתוש. בזמן עקיצת בעלי חיים נוספים מרכיבי הרוק של היתוש נחשפים לתאים שונים בעור ומסוגלים להדביקם. גורם משני- השתלת רקמות/איברים נגועים בנגיף. מרבית הנדבקים הם אסימפטומטיים ועשויים שלא להיות מודעים להדבקה. הנגיף עשוי להישאר בתוך התאים במשך תקופה ארוכה (בהתאם לסוג הרקמה וחומרת המחלה). מעבר נגיפים מהאם לתינוק בזמן הנקה עשוי להיות גורם הדבקה אפשרי נוסף.

פתוגנזה תהליך ההדבקה מורכב ממספר שלבים: בזמן העקיצה נגיפים המצויים ברוק של היתוש מדביקים קרטינוציטים ותאים דנדריטיים בעור. התאים המודבקים נעים דרך כלי הלימפה אל קשרי הלימפה ומשם הנגיף משתחרר אל מחזור הדם. שלב הוירמיה נמשך מספר ימים ובמהלכו הנגיף מסוגל להדביק תאים באיברים שונים- מקרופגים בטחול, תאי אפיתל בכלייה ונוירונים במערכת העצבים המרכזית. נגיפים העוברים את מחסום הדם-מוח מסוגלים להדביק נוירונים ולהביא למותם תוך התנוונות ואבדן מבנה הרקמה.

סימנים וסימפטומים נדבקים אסימפטומטיים (כ-80% מהנדבקים)- אינם מפתחים תסמינים קליניים. קדחת מערב הנילוס (כ-20% מהנדבקים)- חולשה כללית, כאבי ראש, פריחה, חום (לרוב נמוך יחסית) וכאבי שרירים. מחלות נוירולוגיות (פחות מ-1% מהנדבקים)- קדחת המוח, קדחת קרום המוח ושיתוק רפה אקוטי. התסמינים משתנים בהתאם למחלה, החל מחולשת גפיים ופוטופוביה ועד לקומה ומוות.

תגובת מערכת החיסון המולד תאים מודבקים מפרישים ציטוקינים α ו-β המאותתים לכניסת התא למצב אנטיוירלי ומסייעים בהפעלת תאי מערכת החיסון הנרכש. תאי הרג טבעיים מפרישים אינטרפרונים מסוג γ המגבילים את חדירת הנגיף למערכת העצבים הכללית בשלבי ההדבקה הראשוניים מקרופגים מציגים על פני הממברנה שלהם אנטיגנים נגיפיים הקשורים למולקולות MHC מסוג I, באופן המאפשר את זיהויים על ידי תאי T. בנוסף, תאים אלו מפרישים ציטוקינים וכמוקינים המפעילים לימפוציטים ומושכים אותם לאתר הזיהום.

תגובת מערכת החיסון הנרכש תאי T משתתפים בתגובה החיסונית על ידי זיהוי תאים המציגים אנטיגנים נגיפיים על פני חלבוני MHC. תאי T עזר מפרישים ציטוקינים המפעילים לימפוציטים אחרים ותאים דנדריטיים. בנוסף, תאים אלו מפרישים אינטרפרונים מסוג γ משתתפים בתהליכים המגבילים את הפתוגנזה. תאי Tציטוטוקסיים מפרישים ציטוקינים ומביאים להרס התא ישירות או בעקיפין. תאי B הנחשפים לציטוקינים, אינטרפרונים ואנטיגנים נגיפיים מתאימים מופעלים ומתמיינים לתאי פלסמה מפרישי נוגדנים. נוגדני IgM- מתחילים להיווצר כ-3 ימים לאחר ההדבקה נוגדני IgG- מתחילים להיווצר 6-8 ימים לאחר ההדבקה

שיטות אבחון אבחון ההדבקה בנגיף חיוני לצורך מתן טיפול מתאים לחולה וכחלק ושיפור בטיחות השתלת איברים ורקמות. 1. זיהוי ישיר של הנגיף בדגימה מבוסס על הופעת אפקט ציטופתי בתרבית תאים רגישים לאחר חשיפה לדגימה. תהליך זה כרוך במספר קשיים: תקופת הוירמיה של הנגיף נמשכת תקופה קצרה ולרוב מסתיימת לפני שהחולה פונה לקבלת טיפול רפואי. ניתן לזהות את האפקט הציטופתי בתרבית התאים רק לאחר 7 ימים. שימוש בתרביות תאים דורש שמירה על רמות בטיחות וסטריליות גבוהות הקיימות רק במתקני מחקר ומעבדות ספציפיות. קשיים אלו הביאו לפיתוח שיטות מולקולריות וסרולוגיות לאבחון הדבקה בנגיף.

שיטות אבחון מולקולריות 2. שיטות מולקולריות מבוססות על זיהוי חומצות הגרעין הנגיפיות על ידי הגברת באמצעות RT PCR או Real-Time RT PCR. הפריימרים בריאקציה משלימים לגנים C ו-prM המקודדים חלבונים מבניים האופיניים לנגיף. תקופת הוירמיה הקצרה מצמצת את חלון הזמנים בו ניתן לאתר בדגימה את חומצות הגרעין הנגיפיות. בשל חלון הזמנים המצומצם שלהן, השיטות המולקולריות מבוצעות לרוב כתוספת לשיטות הסרולוגיות.

שיטות אבחון סרולוגיות MAC-ELISA .3 (IgM antibody-capture enzyme-linked immunosorbent assay) הינה שיטת האבחון הנפוצה כיום. מבוססת על איתור נוגדני IgM בסרום או ב-.CSF במסגרת אחד המחקר 58% בלבד מדגימות חולים זוהו כחיוביות על ידי MAC-ELISA ו-94% זוהו על ידי שילוב שיטה זו ושיטות מולקולריות. תוצאה חיובית שגויה (false positive) עשויה להתקבל מתגובה צולבת של נוגדנים אשר נוצרו כתוצאה מחיסון/ הדבקה בנגיף אחר מסוג Flavivirus. קיים קושי בהבחנה בין הדבקה אקוטית והדבקה היסטורית- נוגדני IgM עשויים להימצא בדם אף יותר משנה לאחר ההדבקה.

שיטות אבחון סרולוגיות- המשך 4. PRNT (Plaque Reduction Neutralization Test) הינה שיטת אבחון משלימה ל-MAC-ELISA. מבוססת על נטרול נגיפים על ידי נוגדני הדגימה, המתבטא בהפחתה במספר המוקדים הנוצרים בתרבית תאים רגישים. השיטה בעלת רגישות גבוהה ומאפשרת איתור נוגדנים גם כאשר ריכוזם וכושר הקישור שלהם נמוכים ("תקן הזהב" לאיתור נוגדנים). האבחון דורש זמן רב-מבוצעת השוואה בין דגימות שנלקחו בהפרש של שבועיים והופעת המוקדים מתרחשת מספר ימים לאחר הדבקת התאים. שימוש בתרביות תאים דורש שמירה על רמות בטיחות וסטריליות גבוהות הקיימות רק במתקני מחקר ומעבדות ספציפיות.

WNV-חולה ב הדבקה אקוטית תהליך האבחון כיום MAC-ELISA חיובי שלילי PRNT אינו חולה ב-WNV חיובי שלילי WNV-חולה ב הדבקה אקוטית אינו חולה ב-WNV הדבקה היסטורית

IgG Avidity test שיטה סרולוגית המתבססת על בחינת עוצמת קישור נוגדני IgG שבדגימה לאנטיגנים של הנגיף. העקרון מאחורי השיטה הוא השינוי בזיקת נוגדני IgG לנגיף כתלות בזמן שחלף ממועד ממועד ההדבקה: בשלבי ההדבקה הראשוניים הנוגדנים נוצרים באופן לא ייחודי כנגד מגוון רחב של אפיטופים וזיקתם לנגיף נמוכה -low avidity. חשיפה ממושכת לאנטיגנים הנגיפיים משרה חלוקה מוגברת של תאי B המזהים אפיטופים המצויים עליהם (תיאוריית ברירת השבטים). ייחודיות תערובת נוגדני ה- IgG בדם עולה, כך שהם בעלי יכולת קשירה מוגברת אל הנגיף- . high avidity

שלבי השיטה מהילת הדגימה בבופר והדגרתה במשך שעה בתוך פלטת באריות שחלבוני הנגיף ספוחים לדפנותיהן הפנימיות (2 באריות עבור כל דגימה). נוגדני IgG המצויים בדגימה נקשרים לחלבונים בדופן הבארית. הוספת בופר PBS לבארית אחת ותמיסת אוריאה בריכוז 6M לבארית השניה. שתי התמיסות עוברות הדגרה בת 10 דקות. תמיסת האוריאה מביאה לדנטורציה של הנוגדנים ומחלישה את זיקתם לחלבוני הנגיף. שטיפה

שלבי השיטה- המשך 3. הדגרת הבאריות במשך 30 דקות עם תמיסת קוניוגט המכילה נוגדן שניוני הקשור אל האנזיםHRP (Horseradish Peroxidase). הנוגדן השניוני נקשר למקטעי ה- Fcשל נוגדני הדגימה הקשורים לדופן הבארית. 4. הוספת תמיסת סובסטרט (Tetramethylbenzidine) והדגרה בחושך למשך 10 דקות. קשירת TMB ל-HRP שעל הנוגדן השניוני יוצרת תגובת צבע רגישה לאור. 5. הפסקת הריאקציה על ידי הוספת תמיסת עצירה המכילה חומצה גופרתית בריכוז 1M. 6. קריאת בליעת התמיסה בספקטרופוטומטר. שטיפה

דגימות הניסוי כלל בדיקת 221 דגימות סרום שהתקבלו בין השנים 2013-2016 לצרכי אבחון הדבקה ב-.WNV האבחון הקליני של דגימות אלו באמצעות שיטות סרולוגיות המהוות את "תוצאות האמת". 131 דגימות הוגדרו באמצעות שיטות סרולוגיות כחיוביות עבור נוגדני IgG ושליליות עבור נוגדני IgM- "הדבקת עבר" 90 דגימות הוגדרו באמצעות שיטות סרולוגיות כחיוביות עבור נוגדני IgM -"הדבקה אקוטית". 53 מדגימות ההדבקה האקוטית אובחנו ככאלה גם באמצעות שיטות אבחון נוספות -"הדבקה וודאית".

תוצאות מדד זיקה יחסי (RAI): היחס שבין עוצמת הצבע בבארית אשר הודגרה עם תמיסת אוריאה לבין עוצמת הצבע בבארית שהודגרה עם PBS.   IgG positive IgM positive relative avidity index מספר דגימות אחוז מכלל הדגימות >60%- גבוה RAI ערך 98 75% 7 13% 40-60%- טווח ביניים 26 20% <40%- נמוך RAI ערך 5% 39 74% סה"כ 131 100% 53   IgG positive IgM positive relative avidity index מספר דגימות אחוז מכלל הדגימות >70%- גבוה RAI ערך 70 53% 4 8% 40-70%- טווח ביניים 54 41% 10 19% <40%- נמוך RAI ערך 7 5% 39 74% סה"כ 131 100% 53

תוצאות avidity test -ערך ביניים 40-60% תוצאות- המשך ערך ביניים 40-60% ערך ביניים 40-70% תוצאות avidity test -ערך ביניים 40-60% תוצאות אבחון סרולוגי תוצאות avidity test -ערך ביניים 40-70% תוצאות אמת-תוצאות האבחון הסרולוגי הדבקה נוכחית הדבקת עבר סה"כ 39 7 46 98 105 4 70 74 151 43 77 120   ערך ביניים 40-60% ערך ביניים 40-70% משמעות המדד רגישות 85% 91% אחוז בני האדם שאכן נדבקו בנגיף ודגימתם זוהתה כחיובית על ידי שיטת האבחון ספציפיות 93% אחוז בני האדם שלא נדבקו בנגיף ודגימתם זוהתה כשלילית על ידי שיטת האבחון שיעור false negative 15% 9% אחוז בני האדם החולים אשר דגימתם זוהתה כשלילית על ידי שיטת האבחון שיעור false positive 7% אחוז בני האדם שאינם חולים ודגימתם זוהתה כחיובית על ידי שיטת האבחון PPV positive predictive value- ההסתברות שאדם שדגימתו זוהתה כחיובית אכן חולה NPV 95% -negative predictive value הינה ההסתברות שאדם שדגימתו זוהתה כשלילית אינו חולה

תהליך אבחון הכולל IgG Avidity test MAC-ELISA חיובי שלילי IgG Avidity test אינו חולה ב-WNV גבוהRAI בטווח בינייםRAI נמוךRAI WNV-חולה ב הדבקה אקוטית אינו חולה ב-WNV הדבקה היסטורית PRNT חיובי שלילי WNV-חולה ב הדבקה אקוטית אינו חולה ב-WNV הדבקה היסטורית

דיון ומסקנות יתרונות השיטה: מהירות- ביצוע השיטה אינו דורש זמן רב ולוקח שעות אחדות. בניגוד ל-PRNT אין צורך בהמתנה של מספר ימים להיצירת מוקדים. מספר דגימות- השיטה מאפשרת אבחון על בסיס דגימה יחידה, ואף ניתן לעשות שימוש בדגימה שנבדקה במבחן ה- .MAC-ELISA שיטת PRNT מתבססת על לקיחת שתי דגימות בהפרש של שבועיים. פשטות- השיטה קלה לביצוע ומבוססת על פקוטוקול ה-ELIZA הנפוץ. ביצוע השיטה אינו כרוך בעבודה רבה או בשימוש בתרביות תאים ואינו דורש ציוד מיוחד המצוי במעבדות ספציפיות.

דיון ומסקנות חסרונות השיטה: לא ניתן לאבחן על פי השיטה דגימות עם RAI בטווח הביניים (יש לבדוק בשנית דגימות אלו באמצעות שיטה נוספת). רגישות וספציפיות השיטה נמוכות מאלו של שיטת ה-PRNT. הבדל זה מתבטא בשיעורים גבוהים יותר של שגיאות מסוג False Negative ו-False Positive. ערך ה-PPV של השיטה הינו 85% עבור שני טווחי הביניים שחושבו. משמעות הדבר היא ש-15% מהדגימות שאובחנו כחיוביות שייכות לבני אדם שאינם חולים.

דיון ומסקנות הגדרת טווח הביניים של כ-RAI של 40-60% מביאה לשיעור גבוה של שגיאות מסוג False Negative. משמעות הדבר היא ש-15% מבני האדם החולים בנגיף לא יאובחנו ככאלה, כך שיהיה קושי במתן טיפול מתאים. הגדלת הגבול העליון של טווח הביניים ל-RAI של 40-70% משפרת את רגישות השיטה- שיעור שגיאות False Negative יורד ל-9%. החיסרון בהגדלת טווח הביניים הוא עלייה במספר הדגימות שלא ניתן לאבחן באמצעות השיטה (מ-13% ל-21%). קביעת סוג ההדבקה (אקוטית/היסטורית) עבור דגימות אלו תבוצע ב- PRNT.

דיון ומסקנות נדרש מחקר נוסף בכדי להביא לשיפור מדדי הרגישות והספציפיות של השיטה. נכון לעכשיו יישום השיטה דורש התחשבות בגורמים שונים: דחיפות הבדיקה- מושפעת ממצבו הבריאותי וגילו של החולה. זמינות הציוד והמתקנים הדרושים לביצוע שיטות אבחון חלופיות דוגמת PRNT. עלות ערכות הבדיקה המסחריות הנקנות לצורך ביצוע השיטה.