Reproduction Techniques in Animals تکنیک های تولید مثلی در دام Reproduction Techniques in Animals Presented by: A. Riasi Ph. D. in animal nutrition and Physiology http://riasi.iut.ac.ir

تکنیک شبیه سازی حیوانات Cloning Technique

اهداف این جلسه 1- کلونینگ چیست و چه اهمیتی دارد؟ 2- تولید مثل جنسی و غیر جنسی چه تفاوتی دارد؟ 3- تاریخچه انجام کلونینگ؟ 4- کلونینگ با روش انتقال هسته چگونه انجام می شود؟ 5- کلونینگ با روش تقسیم رویان چگونه انجام می شود؟ 6- محدودیت های شبیه سازی چیست؟

اهمیت شبیه سازی ry

اهمیت کلونینگ به عنوان یکی از تکنیک های تولید مثلی: اهمیت شبیه سازی اهمیت کلونینگ به عنوان یکی از تکنیک های تولید مثلی: جلوگیری از انقراض نسل یک گونه یا یک فرد استفاده بهینه از پتانسیل های ژنتیکی دام های پر تولید داشتن گله های یکنواخت از نظر تولید و مدیریت بهتر گله ها صرفه جویی در وقت برای تهیه ی نتایج حیوان مورد نظر سرعت بخشیدن به ارزیابی نتایج به گزینی و به نژادی کمک به دیگر تکنیک های تولید مثلی و تکنیک انتقال ژن و مهندسی ژنتیک ry

تولید مثل جنسی و غیر جنسی در تولید مثل جنسی (تولید مثل دو جنسی)، موجود جدید با به‌اشتراک گذاشتن داده‌های ژنتیکی دو جاندار نر و ماده ایجاد می شود. در تولید مثل غیر جنسی موجود اولیه داده های وراثتی‌اش را عیناً به موجود جدید می دهد. ry

تولید مثل جنسی و غیر جنسی (ادامه) تولید مثل جنسی و غیر جنسی (ادامه) اساس تکنیک شبیه‌سازی تولید مثل غیر جنسی است و هزاران سال است که در طبیعت اتفاق می افتد و به دو روش قابل انجام است: با روش انتقال هسته سلول های بدنی (Somatic cell nucleus transfer) با روش تقسیم رویان (Embryo splitting) گیاهان زیادی به‌ روش شبیه سازی تکثیر می‌یابند. کرم خاکی می تواند با روش تولید مثل غیر جنسی تکثیر شود. دوقلوهای همسان نمونه ای از تولید مثل غیر جنسی هستند. ry

در سال 1983 از این تکنیک در موش استفاده شد و موفقیت آمیز بود. تاریخچه شبیه سازی نخستین بار در سال 1938 نظریه شبیه سازی حیوانات با روش انتقال هسته مطرح شد، اما اولین موفقیت در سال 1952 و در دوزیستان به دست آمد. در سال 1983 از این تکنیک در موش استفاده شد و موفقیت آمیز بود. در سال 1996 دانشمندی بنام Wilmut با همکارانش اولین گوسفند شبیه سازی شده را تولید کردند و آنرا Dolly نامیدند. تولد رویانا اولین بره شبیه سازی شده ایرانی در هشتم مهر سال 1385اتفاق افتاد. ry

تاریخچه شبیه سازی (ادامه) شبیه سازی با روش تقسیم رویان در اواسط دهه 1980 رایج شد و موفقیت هایی نیز داشته است. اولین میمون شبیه سازی شده بنام تترا با روش تقسیم رویان در سال 2000 در آمریکا متولد شد. ry

ry

Dolly's remains are exhibited at the Royal Museum of Scotland. ry Dolly's remains are exhibited at the Royal Museum of Scotland.

مراحل شبیه سازی رویانا (اولین گوسفند شبیه سازی شده ایرانی) رویانا از یک گوسفند نژاد افشاری تولید شد. سلول های سوماتیک مورد نظر از بافت غضروفی و سلول های فیبروبلاست بافت همبند گوش این گوسفند برداشت شد. تعدادی از سلول های حیوان دهنده کشت داده شده و انتخاب شدند. هسته سلول های انتخاب شده که حاوی همۀ داده‌های وراثتی جانور دهنده بود خارج شد. ry

مراحل شبیه سازی رویانا (اولین گوسفند شبیه سازی شده ایرانی) تعدادی تخمک لقاح یافته گوسفند آماده شد و هسته آنها خارج گردید. سپس هسته سلول های سوماتیک در تخمک ها جایگزین شدند. تخمک های دارای هستۀ جدید در محیطی مناسب قرار داده شد تا تقسیم شده و به رویان تبدیل شوند. ry

مراحل شبیه سازی رویانا (اولین گوسفند شبیه سازی شده ایرانی) رویان تولید شده در شرایط برون تنی، در مرحله ی بلاستوسیست به رحم حیوان گیرنده منتقل شد. روز شنبه، هشتم مهرماه 1385، حدود نیمه شب رویانا با روش سزارین متولد شد. رویانا یک نام علمی شناسنامه‌ای هم دارد که به زبان انگلیسی درست شده و اطلاعاتی را دربر دارد . "Royan-ShA-C2" که از چپ به راست نام پژوهشکده، گوسفند (Sheep)-ِ افشاری (A- ) شبیه‌ساخته (Cloned) دوم را دارد. ry

مراحل شبیه سازی رویانا (اولین گوسفند شبیه سازی شده ایرانی) ry

شبیه سازی با روش انتقال هسته (SCNT) در این روش یک حیوان دهنده سلول سوماتیک و یک حیوان دهنده سلول جنسی وجود دارد. مراحل انجام این تکنیک عبارتند از: جمع آوری و کشت سلول های سوماتیک جمع آوری اووسیت و خارج کردن DNA آن جای دادن هسته سلول سوماتیک در اووسیت خالی شده از هسته تحریک الکتریکی و فعال سازی اووسیت هیبریدی کشت برون تنی رویان یک سلولی کلون شده انتقال رویان به رحم یک حیوان گیرنده ry

ry

شبیه سازی با روش انتقال هسته (SCNT) جمع آوری و کشت سلول های سوماتیک: سلول سوماتیک انتخاب شده برای کلونینگ بستگی به گونه حیوان دارد. در گاو سلول های کومولوس، فبیروبلاست، گرانولوزای تخمدان، پستان، ماهیچه، اویدکت، رحم از سلول های سوماتیک انتخاب شده، بلافاصله پس از جمع آوری یا پس از یک دوره کشت طولانی در یک مدیوم مناسب می توان استفاده کرد. ry

شبیه سازی با روش انتقال هسته (SCNT) خارج کردن از DNA اووسیت تهیه شده: تهیه ی اووسیت با روش آسپیره کردن از داخل فولیکول های تخمدانی دام زنده یا تازه کشتار شده بالغ کردن اووسیت تهیه شده در شرایط آزمایشگاه به مدت 18 ساعت در یک مدیوم ویژه استفاده از یک ترکیب ممانعت کننده میکروفیلامنت در محیط کشت برای جلوگیری از لیز شدن اووسیت خارج کردن کروموزم اووسیت با استفاده از ابزارهای میکروجراحی در مرحله متافاز میوز 2

شبیه سازی با روش انتقال هسته (SCNT) ry

شبیه سازی با روش انتقال هسته (SCNT) ry

شبیه سازی با روش انتقال هسته (SCNT) جای دادن سلول سوماتیک در اووسیت: برای اینکار نیاز به ابزارهای بسیار دقیق وجود دارد. بطور معمول تمام سلول سماتیک را در فضای پری ویتلین قرار می دهند، اما در مورد موش ترجیح می دهند تا تنها هسته سلول سوماتیک را بداخل سیتوپلاسم اووسیت تزریق نمایند. بفاصله کوتاهی پس از این مرحله غشای هسته سلول هیبریدی ناپدید می شود و کروماتین آن فشرده می شود.

شبیه سازی با روش انتقال هسته (SCNT) تحریک الکتریکی و فعال سازی: برای یکی شدن سلول ها از روش electrofusion استفاده می کنند. در این روش از یک میدان مغناطیسی (2/2 کیلو ولت در سانتی متر به مدت 40 میکرو ثانیه) استفاده می شود. گاهی پس از تحریک الکتریکی فعال شدن تقسیمات سلولی نیز اتفاق می افتد، اما در برخی موارد برای این منظور نیاز به استفاده از مواد شیمیایی وجود دارد.

شبیه سازی با روش تقسیم رویان برای اینکار باید ار رویان های با کیفیت خوب و دارای درجه A یا B+ استفاده کرد. آماده کردن امکانات مورد نظر از جمله میکرومانیپولاتور تهیه ی رویان های 8 سلولی تهیه ی زوناپلوسیدای خالی با استفاده از رویان های با کیفیت پایین یا اووسیت بدون کومولوس

شبیه سازی با روش تقسیم رویان (ادامه) استفاده از تیغ مخصوص و برش رویان ها برداشتن قطعات رویانی و گذاشتن آنها داخل زوناپلوسیداهای خالی کشت رویان ها برای ادامه تقسیمات سلولی تا مرحله بلاستوسیست انتقال رویان ها به رحم دام های گیرنده

شبیه سازی با روش تقسیم رویان

شبیه سازی با روش تقسیم رویان

شبیه سازی با روش تقسیم رویان Tetra the monkey is different from Dolly the sheep, which was produced using a process called nuclear transfer. Some scientists argue that animals like Dolly are not 100 percent clones because they have genetic material both from the adult cell they were taken from, and from the egg that is hollowed out to make the clone. Tetra was produced by a technique called “embryo splitting.” Here’s how it works: An egg from a mother and sperm from a father are used to create a fertilized egg. After the embryo grows into eight cells, researchers split it into four identical embryos, each consisting of just two cells. The four embryos are then implanted into surrogate mothers. Schatten said that in effect, a single embryo becomes four embryos, all genetically identical.

محدودیت های شبیه سازی نرخ زیاد مرگ و میر جنین های شبیه سازی شده مشکلات تنفسی و قلبی در جنین های شبیه سازی شده رشد غیر طبیعی جفت و کاهش تعداد کوتیلدون ها در نشخوارکنندگان بروز سندرم جنین بزرگ (Large fetus syndrome) محدودیت های مذهبی و اخلاقی