מבנה מוצא השכפול

מבנה מוצא השכפול המינימלי בחיידקי E.coli 3 רצפים (dnaB box) עתירי AT בני 13 בסיסים כ"א (GATCTNTTNTTTT). 4 רצפים (dnaA box) בני 9 בסיסים כ"א (TTATCCACA). אורך המוצא המינימלי 245 זוגות בסיסים

שלושה תנאים לאתחול השכפול הצטברות של חלבוני DnaA התלוייה בסינתזת חלבונים. ה DnaA משמש כגורם רישוי licensing factor במוצא השכפול. היא מגיע למוצא השכפול רק לאחר קישור ל ATP ופעילות ה ATPase שלו חיונית לתהליך האתחול. שיעתוק של אחד הגנים המקיפים את מוצא השכפול. השיעתוק מקל על הפתיחה של הגדיל. סינתזה של דופן התא, המבטיחה שהתא בתהליך של חלוקה.

קדם-איתחול (pre-priming) 1. קישור 4 חלבוני dnaA לאתרי ה dnaA box. לאחר מכן מתווספים מונומרים נוספים בקישור קואופרטיבי המתווך ע"י החלבון DiaA 2. יצירת מבנה חלבוני הליקלי ופיתול של הגדיל סביב הקומפלקס החלבוני. 3. פרימת הגדיל באזור אתרי ה dnaB box ע"י פעילות אנזימטית תלויית ATP של DnaA, בסיוע פעילות השיעתוק בגנים הסמוכים. כל אתרי ה DnaB box צריכים להיפתח. 4. קישור שני מכלולי איתחול (אחד לכל מזלג שיכפול) המורכבים כ"א מהליקאז (dnaB) שישיוני ושישה חלבוני DnaC הקשורים לו. למעשה ה DnaC מעכב את פעילות ההליקז עד השחרור שלו, לאחר הידרוליזת ATP.

איתחול לאחר קישור מכלולי האיתחול משתחררים חלבוני DnaC (helicase loader) מהמכלול תוך הידרוליזה של ATP וחלבוני ההליקאז מתחילים לפרום את הגדיל, כ"א בכיוון שלו. את הסלילים הבודדים קושרים בשלב הקדם-איתחול חלבונים מסוג HU ובשלבים מאוחרים יותר חלבוני SSB. ההליקאז פותח בשלב ראשון אזור של כ 60 זוגות בסיסים, תוך דחיית חלבוני ה DnaA מה DNA. בשלב הזה מגוייסים הגיראז לשם שחרור המתח הפיתולי והפרימאז ליצירת התחלים הראשוניים על שני הגדילים. בכך נגמר שלב האיתחול.

איך מסתיים השכפול?

בד"כ מזלגות השכפול נפגשים בנקודה ההפכית לנקודת המוצא ונופלים בד"כ מזלגות השכפול נפגשים בנקודה ההפכית לנקודת המוצא ונופלים. אם זה לא קורה הם נתקעים באתרי ter ונופלים שם.

החלבון tus נקשר לאתר ter ועוצר את מזלג השכפול הנע בכיוון האחד אבל לא את זה הנע בכיוון השני. הוא עושה זאת ע"י הפרעה לפעילות ההליקאז (unidirectional contrahelicase).

אמרנו שדרך הבסיסית לעכב תיחול-מחדש הוא בעזרת מיתול DNA המוצא החידקי מסוג OriC מכיל מספר חזרות על הרצף הפלינדרומי GATC העוברים מיתול על A. המוצא הממותל למחצה אינו יכול לשמש מוצא לשכפול. עוברות כ 13 דקות מיצירת המוצא הממותל למחצה עד למיתולו המלא ע"י האנזים Dam methylase. בחיידקי dam- השיכפול של פלסמיד ממותל נתקע לאחר פעם אחת.

הסיבה לכך היא חלבון בשם SeqA הנקשר לרצף GATC דווקא כשהוא חצי-ממותל ומונע מחלבוני DnaA להקשר אליו ולפתוח את הגדיל במוצא השכפול. לאחר המתילציה ע"י האנזים Dam methylase נידחה החלבון SeqA מהרצף הממותל ונפתחת האפשרות לתיחול מחדש.

מוטציות ומנגנוני תיקון פרק 20

שינויים ברצף ה DNA - מוטציות תתכנה מוטציות נקודתיות בבסיס אחד או שינויים ברצף ארוך יותר של בסיסים. מוטציות נקודתיות קורות כתוצאה בטעות בתהליך השכפול או כתוצאה של התמרה כימית של בסיס אחד לבסיס אחר. מוטציה נקודתית הוספה הוספה והחסרה קורות כתוצאה מתהליכי שיחלוף או מטעויות בשיכפול. יש גם מקרים של היפוך של קטע DNA. החסרה

מוטציות קורות בקצב טבעי (ואריאציה טבעית) המואץ ע"י גורמים מוטגנים למרות הבדלי הגודל המשמעותיים (סדר גודל שלם) בין גנומים של מיני חיידקים שונים, קצב המוטציה הכללי די קבוע (1:300/generation), מה שמצביע על אופטימום אבולוציוני סביב הקצב הזה. בעיקרון קצב המוטציות יחסי לגודל הגנום ולמספר החלוקות (דורות) בחיידקי E.coli בממוצע מוטציה כל 109 בסיסים בהינתן ממוצע של 1000 בסיסים לגן, נקבל מוטציה כל 106 גנים בהינתן ממוצע של 3000 גנים בגנום חיידקי נקבל מוטציה בערך כל 300 חיידקים בדור

מוטציות נקודתיות קורות בעיקר מתוך שני תהליכים שגיאות בשכפול שינויים כימיים בנוקלאוטיד מסויים

מוטציות נקודתיות מתחלקות לשני סוגים, הראשון שכיח יותר מהשני שינוי (transition) – הפיכת פורין אחד לשני או פירימידין אחד לשני. המרה (transversion) – פורין מוחלף בפירימידין או להיפך.

ההשפעה המוטגנית של חומצה חנקתית היא דוגמא למוטציה נקודתית עקב שינוי כימי בזהות בסיס החומצה גורמת להחלפת האמין של ציטוזין בחמצן והפיכתו לאורציל כלומר C→U. במהלך השכפול הבא U יעבור זיווג עם A כלומר הזוג CG יהפוך ל TA. היעילות של התהליך גבוהה מכדי שמנגנוני התיקון יצליחו להתמודד איתה ולכן חומצה חנקתית הינה מוטגנית.

מוטציה נקודתית יכולה להיגרם גם ע"י בסיס לא שגרתי למשל ברומואורציל (BrdU), נגזרת של תימידין שבה הוחלפה הקבוצה המתילית בברומין, הינו חומר מוטגני שיכול להיכנס ל DNA במקום T בגלל הזיווג שלו עם A. אולם, בגלל נוכחות אטום הברומין ה BrdU יכול לעבור ספונטנית מתצורת הקטו (=O) לתצורת אנול (-OH) שעוברת זיווג עם G וכך הופך הזוג TA לזוג CG במהלך השכפול הבא.

בדיקת מספר המוטציות הספונטניות בכל עמדה של הגן lacI ב E בדיקת מספר המוטציות הספונטניות בכל עמדה של הגן lacI ב E.coli מצביעה על קיומן של נקודות חמות (hotspots) בהן קצב המוטציה הספונטני גבוה פי 10-100 מאשר בשאר העמדות. תתכנה נקודות חמות שונות הרגישות לחומרים מוטגנים שונים.

דוגמה לנקודה חמה היא נוכחות של 5-methylcytocine, ציטוזין שעבר מתילציה, שיכול לעבור דה-אמינציה ולהפוך לתימין. זה ייצור mismatch שאם לא יעבור תיקון יהפוך את הזוג CG לזוג TAבאחד הגדילים לאחר השכפול. הנקודות החמות הללו אינן קיימות בחיידקים שהם חסרי יכול מתילציה של ציטוזין. בתאים אוקריוטים 5-methylcytocine נוכח רק ב 1% מכלל ה DNA אבל אחראי ל 30% מהמוטציות הנקודתיות.

איי CpG (CpG islands), המכילים ריכוז גבוה של רצפי CG, הם נקודה חמה למוטציות נקודתיות ספונטניות בגלל שילוב של תהליכי מתילציה ודה-אמינציה מתילציה דה-אמינציה דה-אמינציה

המוטציה הזו שכיחה הרבה יותר מאשר זו הנובעת מדה-אמינציה של ציטוזין והפיכתו לאורציל שכן מנגנוני התיקון רגישים הרבה יותר לנוכחות אורציל ב DNA. לכן למוטציה C→U סיכוי הרבה יותר גבוה לעבור תיקון מאשר CME→T.

התוצאה תהיה החלפה של C ב T אין תיקון תיקון

מנגנוני תיקון

בגנום האנושי ישנם יותר מ 130 גנים המשתתפים במנגנוני התיקון של ה DNA

תיקון ישיר (direct reversal) מתבצע ע"י אנזימים ההופכים את התהליך שיצא את השינוי. למשל אור UV גורם להיווצרות pyrimidine dimers כמו קישור בין שני תימידינים סמוכים. ב E.coli מתקן האנזים photolyase את הנזק ע"י פתיחת הקשרים הקוולנטיים בין הפירימידינים והחזרת המצב לקדמותו.

מנגנוני תיקון מיוחדים סורקים כל הזמן את ה DNA בחיפוש אחר אירועי mismatch. כשנמצא אירוע כזה מופעלים בד"כ מנגנוני תיקון בשיטת החילוץ (excision repair) המתחלקים לשני חלקים: חילוץ בסיס (base excision) מערב שליפת בסיס אחד והחלפתו בבסיס המתאים לבן הזוג. אחד המנגנונים המרכזיים הוא האנזים DNA uracil glycolase המחליף את בסיס ה uracil שנוצרו עקב דה-אמינציה של ציטוזין.

הגליקוזילאז פועל בדרך דומה לזו בה פועל המתילאז, ע"י שליפת בסיס (base flipping) מתוך הגדיל וטיפול בו. הוא מזהה את בסיסי האורציל, שולף אותם לאתר הפעיל שלו וחותך אותם.

2. חילוץ נוקלאוטידים (nucleotide excision) פועל ע"י חילוץ קטע קצר של הסליל הכולל את הבסיס הפגוע וסינתזה מחודשת של הקטע החסר על בסיס הסליל המשלים. ישנן מספר מנגנוני תיקון מקבילים הפועלים בשיטה זו.

שלבי פעולת התיקון בשיטת חילוץ נוקלאוטידים 1. זיהוי אזור הנזק, בעיקר לפי השינוי במבנה ה DNA 2.שבירה אנדונוקלאוליטית משני צידי אזור הנזק 3. עיכול אקזונוקלאוליטי של אזור הנזק 4. פולימריזציית DNA תוך שימוש בגדיל המשלים כתבנית ובקצה החופשי 3’OH כתחל 5. ליגציה של החיבור בין הנוקלאוטידים

למערכת ה Uvr תפקיד מרכזי ב excision repair 1. הדימר UvrA,B סורק את הגנום בחיפוש אחר עיוותים מבניים שמקורם בנזק מקומי 2. עם גילוי נזק מקומי UvrC מחליף את UvrA 3. הדימר UvrB,C שובר את הסליל הניזוק משני צידי הנזק, 7 בסיסים בכיוון 5’ ו 3-4 בסיסים בכיוון 3’. 4. UvrD משחרר את הקטע החתוך מהגדיל בעזרת פעילות הליקלית 5. DNA polymerase I מסנתז את הקטע החסר. בגלל הקטע הקצר שמוחלף (12 בסיסים) נקרא התהליך short patch repair

אבל איך נדע איזה מהסלילים הוא התבנית ואיזה המשוכפל? נטפל בשגיאות הנובעות משיכפול שגוי. איך נדע איזה מהסלילים נכון? כנראה שסליל התבנית הוא הנכון והמשוכפל מוטעה. אבל איך נדע איזה מהסלילים הוא התבנית ואיזה המשוכפל?

דרך הבסיסית להבחין בין שני הסלילים הוא בעזרת מיתול DNA האנזים Dam methylase מזהה את הרצף הפלינדרומי GATC וממתל אותו בבסיס A. סליל התבנית ממותל לחלוטין בעוד שהסליל המשוכפל אינו ממותל מיד לאחר השכפול. כך ניתן להבחין בין שני הסלילים.

במידה ויש שגיאת שיכפול הסליל הלא-ממותל מתוקן לפי סליל התבנית הממותל

חלבוני ה MutS/L נקשרים לנקודת השגיאה חלבוני ה MutS/L נקשרים לנקודת השגיאה. לאחר מכן הם מזהים את רצף ה GATC הקרוב וקושרים אליו חלבון MutH מסוג אנדונוקלאז. החלבון הזה שובר את הסליל הלא-ממותל שעובר אח"כ עיכול ע"י מספר נוקלאזות באזור שגודלו 1kb< מסביב לרצף ה GATC. החלק החסר מושלם מאוחר יותר ע"י פולימראז III וכך מוחלף אזור השגיאה. בגלל הקטע הארוך שמוחלף נקרא התהליך הזה: long patch repair

מערכת ה Mut משתתפת גם בתיקון נזקים שנגרמים על-ידי החלקה בשכפול (replication slippage)

שיטות בביולוגיה מולקולרית PCR - Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction שיטה המשמשת לשכפול של מקטעי DNA פותחה ב- 1983 ע"י קארי מוליס (פרס נובל) השיטה מבוססת על תהליך השכפול של ה- DNA בתא ניתן להגביר כמויות זעירות של מקטע נתון פי מיליארדים ובזמן קצר של כמה שעות

Polymerase Chain Reaction מכשיר ה - PCR מסוגל לחמם ולקרר במהירות מספר רב של מבחנות

Polymerase Chain Reaction אפשר לשכפל רק את הקטע הרצוי מתוך כל ה- DNA של התא

שלבים שלב ראשון פרימה - הפרדות הגדילים בערך 90° שלב ראשון פרימה - הפרדות הגדילים בערך 90° שלב שני איחוי - הצמדות התחלים בערך 50° שלב שלישי התארכות - שכפול הקטע שבין התחלים בערך 70°

חומרים סליל התבנית בסיסים חופשיים תחלים (קדמי ואחורי) פולימראז תמיסת בופר יוני מגנזיום

אנימציה

Polymerase Chain Reaction http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU

Taq Polymerase בעיה טמפרטורת הפרימה הורסת את אנזימי הפולימראז, שטמפרטורת הפעילות שלהם בסביבות 37° פיתרון האנזים taq polymerase מופק מחיידקים תרמופיליים מסוג Thermus aquaticus החיים במעיינות חמים. טמפרטורת הפעילות האופטימלית שלו היא 75-80° והוא עמיד בטמפרטורות גבוהות. בעיה חוסר פעילות הגהה (3’-5’ exonuclease) שגורמת לאחוז שגיאות יחסית גבוה 1:10,000 פיתרון אם רוצים להגביר רצף ארוך ברמת דיוק גבוהה משתמשים באנזים אחר, pfu polymerase שלו רמת דיוק גבוהה 1:1,000,000 אבל קצב פעילות נמוך יותר (פי 2-4) משל ה taq polymerase.

תכנון תחלים צריך שני תחלים לריאקציה: Forward ו- Reverse אורך התחל בסביבות 18-22 בסיסים TM אופטימאלי של התחלים הוא בין 55° ל 60° יש להימנע מתחלים היוצרים מבנים שניוניים Hairpin

שימושים יצירת DNA כימרי זיהוי רגיש ביותר של נוכחות רצף מסוים לדוגמה: אבחון טרום לידתי הכנסת שינויים ב- DNA דרך התחלים (DNA כימרי) זיהוי שוני גנטי באוכלוסייה - allele-specific PCR - מעקב אחר Short Tandem Repeats (STR) לדוגמה: זיהוי פלילי מדידת הבדלים בכמות התחלתית של רצפים שונים בדגימה (PCR כמותי)

אמפליפיקציה מעריכית? בפועל הראקציה אינה עומדת בנטל והגידול הופך בשלב מסויים (השלב המישורי) ללינארי