In the Name of GOD

روش های تشخیص استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین (MRSA) و استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به ونکومایسین (VRSA) دکتر هنگامه زندی عضو هیئت علمی گروه میکروب شناسی دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد 94/9/27

ẞ-lactams

Penicillins Active against all ß-hemolytic streptococci, meningococci and most G(+) anaerobes, poor activity against G(-) rods. Similar to natural penicillins ,except enhanced activity against Staphylococci Natural penicillins: benzylpenicillin (penicillinG), phenoxymethyl penicillin (penicillin V) Penicillinase – resistant penicillins methicillin, naficillin, oxacillin, cloxacillin

penicillins Broad-spectrum penicillins : aminopenicillins (ampicillin , amoxicillin , carbenicillin, ticarcillin), ureidopenicillins (piperacillin) ß-Lactam with ß-lactamase inhibitor: ampicillin/sulbactam , amoxicillin/clavulanate , ticarcillin/clavulanate , piperacillin/tazobactam Activity against G(+) cocci , active against some G(-) rods with piperacillin the most active Activity similar to natural ß-lactams, plus improved activity against ß-lactamase producing Staphylococci and selected G(-) rods, not all ß-lactamases are inhibited , piperacillin/tazobactam is most active

Cephalosporins and cephamycins Narrow spectrum : (Cephalosporin I) cephalexin, cephalothin, cefazolin, cephapirin, cephradine Expanded-spectrum cephalosporins : (Cephalospoin II) cefaclor, cefuroxime Activity equivalent to oxacillin against G(+) bacteria , some G(-) activity (E.coli, klebsiella, p.mirabilis,…) Activity equivalent to oxacillin against G(+) bacteria, improved G(-) activity (Enterobacter, Citrobacter, Proteus)

Cephalosporins and cephamycins Activity similar to expanded-spectrum cephalosporins but less susceptible to ßlactamase Activity equivalent to oxacillin against G(+) bacteria, improved G(-) activity to include Pseudomonas Activity equivalent to oxacillin against G(+) bacteria, marginally improved G(-) activity Expanded- spectrum cephamycins : cefotetan,cefoxitin Broad spectrum : ( cephalospoin III) cefexime, cefotaxime, ceftriaxone, ceftazidime Extended spectrum: (cephalosporin IV) cefepime, cefpirome

مکانیسم های مقاومت باکتری ها نسبت به آنتی بیوتیک ها مکانیسم های مقاومت باکتری ها نسبت به آنتی بیوتیک ها مکانیسم های مقاومت باکتری ها نسبت به آنتی بیوتیک ها: تولید آنزیم های غیر فعال کننده دارو تغییر در محل اثر دارو در درون باکتری تغییر در ورود دارو به باکتری تغییر در خروج دارو از باکتری

Action of a b-lactamase H2O N Inactive penicilloate O COOH S Active penicillin HN O OH COOH

MRSA از سالهای 1950سويه هاي استافيلوكوك با ايجاد بتالاكتاماز توانايي تخريب پني سيلين را كسب كرده و نسبت به آن مقاوم شدند تا جائيكه امروزه 95% آنها به پني سيلين مقامند. از سالهای 1960، يك پني سيلين نيمه صناعي بنام متي سيلين كه نسبت به بتالاكتاماز مقاوم است در درمان بكار گرفته شد ولي مدتي پس از آن، استافيلوكوكهاي مقاوم به متي سيلين ( MRSA) هم مشاهده گرديد. هم اکنون در درمان عفونت های MRSA از ونکومایسین استفاده می شود. برای اولین بار در سال 1996 استافیلوکوکوس اورئوس با حساسیت کاهش یافته به ونکومایسین شناخته شد.

MRSA ژن mecA كه عامل مقاومت به متي سيلين است، نوعي گيرنده دارو در سطح باكتري را كد مي كند كه PBP2a نام داشته و تمايل اندكي براي اتصال به آنتي بيوتيكهاي بتالاكتام دارد. مقاومت به متي سيلين يعني مقاوم بودن به تمامي پني سيلين هاي مقاوم به پني سيليناز مانند اگزاسيلين، گلوكزاسيلين دي كلوگزاسيلين و نفي سيلين. استافيلوكوكهاي مقاوم به متي سيلين (MRS) مي توانند به تمام آنتي بيوتيكهاي بتالاكتام، تتراسيكلين، ماكروليدها، لينكوزاميدها، آمينوگليكوزيدها، كينولونها، فلزات سنگين و آنتي سپتيك ها نيز مقاوم باشند.

روش های فنوتیپی جهت تعیین MRSA دیسک دیفیوژن ( تعیین حساسیت به سفوکسیتین) تعیین MIC اگزاسیلین (میکرودایلیوشن و اگار دایلیوشن) E test (اگزاسیلین ) روش Agar screening لاتکس اگلوتیناسیون MRSA کروم آگار

مقاومت به متی سیلین در کدام گونه های استافیلوکوک بررسی می گردد؟ مقاومت به متی سیلین در کدام گونه های استافیلوکوک بررسی می گردد؟ استافیلوکوکوس اورئوس استافیلوکوکوس لاگدوننسیس استافیلوکوک های کواگولاز منفی

چرا سفوکسیتین و اگزاسیلین بجای متی سیلین در تعیین MRSA مورد استفاده قرار می گیرد؟ متی سیلین در سال های اخیر تولید نمی شود. برای دیسک دیفیوژن و تعیین MIC متی سیلین باید به محیط NaCl اضافه نمود و حداکثر در دمای 33 درجه سانتی گراد انکوبه کرد. اگزاسیلین در مقایسه با متی سیلین، فعالیت خود را در حین ذخیره سازی بهتر حفظ می کند. اگزاسیلین سویه های Hetero-resistant را بهتر تعیین می کند. سفوکسیتین القا کننده بهتری برای ژن mecA است. Endpoint سفوکسیتین در روش دیسک دیفیوژن واضح تر از اگزاسیلین است و راحتتر خوانده می شود. کلوگزاسیلین نباید بجای اگزاسیلین جهت تعیین MRSA بکار رود زیرا ممکن است مقاومت به متی سیلین را مشخص نکند.

Heterogeneous MRSA برای تعیین Heterogeneous MRSA، لازم است در ازمون اگار دایلیوشن و یا براث دایلوشن اگزاسیلین، به محیط کشت NaCl ( 2% W/v ; 0.34mol /L) اضافه گردد. در روش دیسک دیفیوژن اگزاسیلین نیازی به مواد افزودنی نمی باشد. جهت تعیین مقاومت به اگزاسیلین، انکوباسیون باید حداکثر در دمای 35 درجه سانتی گراد انجام شود. جهت تعیین Heterogeneous MRSA در روش دیسک دیفیوژن لازمست حتما حداقل 24 ساعت حتی بهتر است 48 ساعت گرمخانه گذاری گردد. در صورت استفاده از سفوکسیتین یا اگزاسیلین برای گونه های استافیلوکوک، قطر هاله عدم رشد در برابر نور انعکاسی خوانده میشود. هر گونه رشد قابل تشخیص در منطقه از مهار اگزاسیلین نشان دهنده مقاومت اگزاسیلین است

نکاتی در مورد روش های تعیین MRSA اگر در روش دیسک دیفیوژن سفوکسیتین ( 30μg)، نتیجه نیمه حساس بدست امد، لازمست که MIC سفوکسیتین تعیین گردد و از نظر ژن mecA مورد بررسی قرار گیرد. در مورد استافیلوکوک های کواگولاز منفی، فقط دیسک دیفیوژن سفوکسیتین می تواند مقاومت وابسته به ژن mecA را نشان دهد. حساسیت روش دیسک دیفیوژن سفوکسیتین، مشابه تعیین MIC اگزاسیلین است ولی ویژگی بالاتری دارد ( دیسک دیفیوژن سفوکسیتین دقیق تر از MIC اگزاسیلین می تواند سویه های حساس به اگزاسیلین را تعیین نماید). ازمایش سفوکسیتین جهت سنجش مقاومت ناشی از ژن macA به اگزاسیلین در استافیلوکوکوس اورئوس و استافیلوکوک های کواگولاز منفی مورد استفاده قرار می گیرد و بصورت مقاومت به اگزاسیلین گزارش می شود.

نکاتی در مورد روش های تعیین MRSA سویه های استافیلوکوک مقاوم به اگزاسیلین بدون توجه به نتیجه آنتی بیوگرام انتی بیوتیک ها به تمام انتی بیوتیک های بتالاکتام ( پنی سیلن ها، سفالوسپورین ها، کارباپنم ها، سفم ها، بتالام/مهار کننده بتالاکتام ها مقاوم گزارش می شوند. زیرا در درمان پاسخ ضعیفی به این آنتی بیوتیک ها میدهند. برای سویه های حساس به اگزاسیلین، نتایج سفم ها، بتالاکتام/مهار کننده بتالاکتام و کارباپنم ها گزارش می گردد

VRSA و VISA از سال 1952 گلیکوپپتیدهایی مانند ونکومایسین و تیکوپلانین بصورت موفقیت آمیز در درمان عفونت های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به پنی سیلین و مقاوم به متی سیلین مورد استفاده قرار می گیرد. بیش از سه دهه در استافیلوکوکوس اورئوس نسبت به ونکومایسین کاهش حساسیت مشاهده نشد. کاهش حساسیت استافیلوکوکوس اورئوس نسبت به ونکومایسین اولین بار در سال 1996 مشاهده شد. در حال حاضر استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به ونکومایسین (VRSA) در جهان به طور گسترده وجود ندارد. اما سطح پایین مقاومت استافیلوکوکوس اورئوس نسبت به ونکومایسین (VISA ) به وفور گزارش شده است در حال حاضر تاثیر ونکومایسین با ایجاد سویه های استافیلوکوکوس اورئوس Heteroresistant, intermediate resistant, completely resistant سوال بر انگیز شده است.

Vancomycin Heteroresistant S. aureus (hVISA) - سویه هایی هستند که از نظر فنوتیپی بروش میکرودایلیوشن نسبت به ونکومایسین حساس هستند، ولی با بررسی های بیشتر مشخص می شود که جمعیت های سلولی با حساسیت کاهش یافته به ونکومایسین را نیز دارند. - روش فنوتیپی خاصی برای تشخیص این سویه ها وجود ندارد. 1- افزایش دوره انکوباسیون و استفاده از مقدار بیشتری باکتری می تواند در تشخیص این نوع کاهش حساسیت کمک کند. 2- کلنی های کوچکتر از طبیعی در کشت خالص و یا تغییر رنگ و همولیز می تواند نشاندهنده این نوع کاهش حساسیت باشد glycopepti Intemediate S. aureus (GISA) یا Vancomycin‐intermediate S. aureus (VISA) - سویه هایی که دارای حساسیت کاهش یافته نسبت به ونکومایسین هستند و در جهان و ایران به وفور گزارش شده اند.

Vancomycin‐resistant S. aureus (VRSA) - اولین بار در سال 2002 دیده شد. سویه هایی هستند که ژن مقاومت VanA را از انتروکوک ها کسب کرده اند تاکنون فقط 33 سویه استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به ونکومایسین در جهان به اثبات رسیده است (13 سویه از USA، 16 سویه از هند، یک سویه از پاکستان و سه سویه از ایران) که 32 سویه MRSA بودند. لازم به ذکر است که هیچیک از سویه های هند و پاکستان و ایران ( بجز یک سویه) تایید نگردیده است.

CLSI در سال 2006، Breakpoint ونکومایسین را در مورد استافیلوکوکوس اورئوس از 4 μg/ml به 2 μg/ml کاهش داد. Vancomycin susceptible : ≤ 2 μg/ml Vancomycin intermediate: 4-8 μg/ml (VISA) Vancomycin resistant : ≥16 μg/ml (VRSA)

روش های سنجش حساسیت به ونکومایسین در استافیلوکوکوس اورئوس Broth Microdilution ( گلد استاندارد) Agar dilution E.test روش های تجاری (Vitek‐2, Phoenix, Microscan) Vancomycin agar screen test ( باید با MICتایید گردد) Disk diffusion( از سال 2013 روش قابل قبولی نیست). براساس پروتکل CLSI، برای تعیین حساسیت استافیلوکوک ها نسبت به ونکومایسین باید MIC تعیین شود، زیرا در استافیلوکوکوس اورئوس حساسیت و حساسیت بینابینی قابل تفریق نیست. در استافیلوکوک های کواگوالاز منفی حتی ایزوله های مقاوم از حساس ها قابل تفریق نیست.

مقاومت القایی به کلیندامایسین

مقاومت القایی به کلیندامایسین بروش D test

THANK YOU