אוניברסיטת בר אילן פרוייקט גמר- ביולוגיה חישובית אוניברסיטת בר אילן פרוייקט גמר- ביולוגיה חישובית חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing שם: מירי לוי מנחה: ד"ר סול עפרוני

חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing MicroRNAs(miRNAs) Non-coding RNA microRNAs Small RNA קבוצה של small RNA משמשות תפקיד חשוב במגוון של תהליכים תאיים מולקולות המבצעות רגולציה על ה mRNA miRNA יכול למנוע את תרגום ה mRNA לחלבון או לגרום לפירוקו ע"י היברידיזציה עם קצה ה 3' UTR. כתוצאה מכך, בקרת ה miRNA משפיעה על ביטוי גנים לאחר שיעתוק

חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing miRNA משועתק ע"י RNA polymerase II כ pri-miRNA- פירוק ה pri-miRNA למבנה stem loop באורך של 60-70 נוקלאוטידים, שנקרא pre-miRNA , תהליך זה מתבצע ע"י אנדונוקלאז Drosha RNase III pre-miRNA מועבר מהגרעין לציטופלסמה מתקבל ,miRNA duplex RNA דו גדילי באורך 22~ נוקליאוטידים אחד הגדילים מהדופלקס, הmiRNA ,באמצעות קומפלקס RISC יעכב את הביטוי של גן המטרה. והגדיל השני miRNA*, , יובל לדגרדציה.

סרטן וסרטן השד המחלה מתאפיינת בצמיחה בלתי מבוקרת של תאים בגוף. חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing סרטן וסרטן השד המחלה מתאפיינת בצמיחה בלתי מבוקרת של תאים בגוף. נובעת מגורמים: גנטיים סביבתיים גנטיים וסביבתיים סרטן השד המחלה הממארת השכיחה ביותר בקרב נשים בעולם המערבי.

סרטן השד – גורמים גנטיים חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing סרטן השד – גורמים גנטיים שני גנים שמהווים הגורם השכיח ביותר לסרטן שד תורשתי BRCA1 BRCA2 גנים אלו ממלאים תפקידים חשובים ושונים בתא בתיקון נזקים ל DNA. ההנחה היא שיש גנים נוספים שעדיין לא זוהו, המעלים את הסיכוי לחלות בסרטן השד. נשים נשאיות של מוטציות ב BRCA1 ו-BRCA2 מצויות בסיכון גבוה לחלות בסרטן שד ובסרטן שחלה. הסיכון בקרב נשאיות מוערך בכ-50%-80% להתפתחות סרטן השד , לעומת כ-12% -סיכון להתפתחות המחלה באוכלוסייה הכללית.

חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing בעשורים האחרונים, מחקרים רבים מראים שביטוי פרופיל גנטי יכול להוות כלי שימושי לאבחון סוג הסרטן או לבחירת סוג הטיפול. פרופיל הביטוי של miRNAs יכול להגדיר סוגי סרטן. היות ו miRNAs משחקים תפקיד מרכזי במגוון תהליכים תאיים כמו מטבוליזם, אפופטוזיס, התמיינות והתפתחות הם גם קשורים למחלות כמו סרטן. הקשר בין miRNAs וסרטן השד נתמך ע"י מחקרים הבוחנים ביטוי miRNAs בסרטן השד בשורה של דגימות קליניות. מחקרים אלו מצאו כי ישנו פרופיל ביטוי miRNAs השונה ברקמות סרטניות מרקמות נורמליות. ישנם miRNAs המתבטאים בעודף וישנם כאלה בעלי ביטוי נמוך.

Next-generation sequencing חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing Next-generation sequencing מאז פרסום רצף הגנום האנושי, תחום הגנומיקה השתנה באופן משמעותי וזמינותו של מידע זה הוביל לשגשוג טכנולוגי. פיענוח רצפי DNA וRNA הכרחי כמעט בכל ענפי הביולוגיה, עם הופעתו של Sanger sequencing מדענים יכלו להשתמש במידע גנטי של כל מערכת ביולוגית נתונה, טכנולוגיה זו הפכה נפוצה אך היתה בעלת מגבלות רבות ביכולת התפוקה, מהירות, רזולוציה. לעיתים נמנע מידע הכרחי בשל מגבלות אלה. לשם השוואה, בריצוף Sanger השלמת הריצוף היתה אורכת ימים או שבועות כתלות באורך הגנום, לעומת זאת בטכניקת next generation sequencing השלמת הריצוף אורכת מספר שעות ללא תלות באורך הגנום.NGS מרחיב את תהליך הריצוף למיליוני ריאקציות באופן מקבילי, ומאפשר לחוקרים לשאול כמעט כל שאלה גנומית. האתגרים שמגיעים עם פריצת דרך זו הם רבים, ניתן להשתמש בשיטה כדי לנבות ולאפיין מחלות שמקורן בשינויים גנטיים.

חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing תוכנות ביואינפורמטיות המשמשות לחיזוי miRNAs חדשים כיום יש מספר רב של תוכנות ביואינפורמטיות שפותחו ע"מ לחזות miRNAs חדשים לדוג'miRDeep , miRanalyzer, miRExpress, miRTAP,mirTools. בפרוייקט זה השתמשתי בשתי תוכנות: miRanalyzer ו miRDeep2. לשתי תוכנות אלו יש שתי גרסאות:web server ו stand alone. בפרוייקט זה השתמשתי בגרסה השנייה כיוון שיש לה מספר יתרונות לדוג' ניתן לשנות ערכי פרמטרים ולהוסיף ספריות באופן עצמאי.

לימוד מבנה הקבצים וקריאת מאמרים על הרקע הביולוגי והחישובי של התוכנות. חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing מהלך העבודה: איסוף המידע התקנת התוכנות לימוד מבנה הקבצים וקריאת מאמרים על הרקע הביולוגי והחישובי של התוכנות. הרצת כמות גדולה של דגימות וניתוח הפלטים-תוצאות הסקת מסקנות ועיבוד חישובי.

חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing איסוף המידע : ה TCGA החל כתכנית פיילוט בשנת 2006. הפרויקט אישר כי מיפוי של שינויים גנומיים מאפיין סוגי סרטן ספציפיים. בפרוייקט ה TCGA נבחנות מספר גדול מאוד של דוגמאות – 500 דגימות עבור כל סוג גידול. זאת בכדי לייצר פרופיל גנטי מקיף של כל סוג סרטן . כל צוותי מחקר TCGA עובדים על אותן הדגימות. התוצאה היא מבט כולל של חקר סרטן ברמה הגנומית.

miRanalyzer

Miranalyzer מספק את המידע הבא: חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing כתוצאה מפיתוח שיטת הריצוף next generation sequencing נוצר הצורך להתמודד עם כמות גדולה של data ולפתח כלים ביואינפורמטיים שמנתחים את הפלט של סוג ריצוף זה. לאור זאת פיתחו את תוכנת ה miranalyzer תוכנה שמאפשרת כלי לניתוח הנתונים עבור small RNA שמתקבלים מ deep sequencing experiments כלי זה דורש קובץ input פשוט של שמכיל רשימה של ה- reads (הפלטים של מכונת הNGS) הייחודיים ומספר העותקים שלהם. Miranalyzer מספק את המידע הבא: מזהה את כל ה miRNA הידועים שמופיעים במאגר miRBase. חוזה miRNAs חדשים.

Weka : אוסף של אלגוריתמים לניתוח נתונים ומודלים חיזויים. חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing Miranalyzer משתמש ב: Weka : אוסף של אלגוריתמים לניתוח נתונים ומודלים חיזויים. Vienna RNA package: משמשת לחיזוי המבנה השניוני של ה RNA . Bowtie: כלי יעיל לביצוע alignment ל short reads .

miRBase זהו מסד נתונים שמכיל את הרצפים הידועים של microRNA. מטרותיו: חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing miRBase זהו מסד נתונים שמכיל את הרצפים הידועים של microRNA. מטרותיו: -לספק מערכת שמות עקבית של microRNAs -איגוד של כל רצפי ה microRNAs הידועים - לצבור ידע על microRNA targets. -מכיל מידע על מיקום הmiRNA ואת הרצף.

תרשים זרימה של אופן פעולת התוכנה miRanalyzer חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing תרשים זרימה של אופן פעולת התוכנה miRanalyzer FASTQ Perl script Read count(RC) Clean RC Aligns to DB Algorithms Keep for microRNA prediction

miRDeep2

חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing גם תוכנה זו משתמשת ב Bowtie ו Vienna RNA package התוכנה נותנת את המידע הבא: מזהה את ה Reads המתאימים, את אורך הרצף שלהם, מיקומים שאליהם מופה , רצף הread , מיקום של הread בגנום ועוד. miRDeep2 package מכיל 3 מודולים: 1.miRDeep2 module שמזהה miRNAs ידועים וחדשים, מודול ראשי. 2.Mapper module שממפה את ה reads לגנום. 3.Quantifier module שסוכם את ה reads של ה miRNAs הידועים.

השוואה בין התוכנות

חווית משתמש במהלך ההתקנה מורכב ידידותי חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing miRanalyzer mirDeep2 שפה Java Perl Open source לא כן פירוט קריאות חיצוניות לא קיים קיים מספר חיזויים רב מועט זמן ריצה קצר מתמשך פורמט פלט txt html, pdf, חווית משתמש במהלך ההתקנה מורכב ידידותי

חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing מהלך העבודה הרצת סט של 66 דגימות בשתי התוכנות לקיחת הנתונים הרלוונטיים מכל פלט ביצוע חיתוך בין פלטי התוכנות במטרה לקבל בסיכוי גבוהה יותר חיזויים שהם TRUE POSITIVE אופן הביצוע של החיתוך- לקיחת עמודות מתאימות יצירת קובץ פלט גדול שמכיל את החיזויים המשותפים עבור שתי התוכנות

חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing החיתוך בין התוכנות החיתוך בין הpredicted novel miRNAs המשותפים לתוכנות miRDeep ו-miRanalyzer.

חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing ER+ לעומת ER- : בתאי סרטן שד מסוימים , קיימים על פני שטח התא קולטנים לאסטרוגן. סרטן מסוג זה נקרא סרטן חיובי לקולטני אסטרוגן(ER+), השפעתו מעודדת הצמיחה של ההורמון אסטרוגן עלולה במקרים מסוימים לגרום לצמיחתה של רקמה ממארת בשד.

חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing PR+ לעומת PR-: בתאי סרטן שד מסוימים קיימים קולטנים לפרוגסטרון, תאים אלו זקוקים לפרוגסטרון כדי להתפתח, גידולים מסוג זה נקראים חיוביים לקולטני פרוגסטרון(PR+) , בשונה מגידולים שהורמון זה לא מאיץ את התפתחותם ונקראים PR-. פרוגסטרון הוא הורמון מין המופרש בעיקר מן הגופיף הצהוב שבשחלה לאחר ביוץ. הפרוגסטרון מופרש במידה קטנה יותר מבלוטת יותרת הכליה, מן השליה במהלך ההריון , ובגברים מהאשכים.

חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing HER-2: Human Epidermal Growth Factor Receptor הוא חלבון מסוג מיוחד ( קולטן) הנמצא באופן תקין ברמות נמוכות על פני השטח של תאים ברקמת השד. ל HER2 תפקיד חשוב בבקרה על גדילתם וחלוקתם של תאים תקינים. פעילות יתר שלו גורמת לחלוקה מוגברת של תאים, נמצא כי בערך 20 אחוזים מגידולי השד החודרניים מבטאים חלבון זה בכמות גדולה מהרגיל. חלבון זה שולט על תהליך החלוקה וההתפשטות של תאי הגידול הסרטני בשד. גידולים המבטאים כמות גדולה מהרגיל של החלבון נקראים HER2-positive. נשים חולות סרטן שד המאובחנות כסובלות מרמות גבוהות של HER2 סובלות מצורה אלימה במיוחד של סרטן שד.

המטרה למעשה, רציתי למצוא את ה miRNAs המשותפים לכל תת קטגוריה. חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing המטרה למעשה, רציתי למצוא את ה miRNAs המשותפים לכל תת קטגוריה. לבדוק מהם ה miRNAs שבהם יש זהות בין כל תת סוג של קטגוריה, וע"י מציאת ההבדלים בין תת הקטגוריות למצוא miRNAs שיאפיינו את תת סוג הסרטן. הצגת התוצאות באמצעות שימוש בכלי R, באמצעות VENN DIAGRAM

Predicted novel miRNAs ER+ and ER- חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing Predicted novel miRNAs ER+ and ER- 11 predicted novel miRNAs המבדילים את הדגימות ER- שנחזו ע"י שתי התוכנות, וכן ישנם 46 predicted novel miRNAs המבדילים את הדגימות ER+

Predicted novel miRNAs PR+ and PR- חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing Predicted novel miRNAs PR+ and PR- 11 predicted novel miRNAs המבדילים את הדגימות PR- שנחזו ע"י שתי התוכנות, וכן ישנם 18 predicted novel miRNAs המבדילים את הדגימות PR+

Predicted novel miRNAs HER2+ and HER2- חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing Predicted novel miRNAs HER2+ and HER2- 8 predicted novel miRNAs המבדילים את הדגימות HER2- שנחזו ע"י שתי התוכנות, וכן ישנם 21 predicted novel miRNAs המבדילים את הדגימות HER2+

חיזוי miRNAs ברקמות סרטן השד באמצעות small RNA sequencing מסקנות והמשך.... החשיבות של ביטוי miRNAs במצבים סרטניים קיבלה משמעות חדשה בשנים האחרונות, מולקולות אלו משחקות תפקיד משמעותי במצבי חולי ותורמות להתפתחות גידולים סרטניים. בתוצאות שקיבלתי נראה שיש miRNAs משותפים לכל תת סוג של גידול בסרטן השד, הmiRNAs השונים בין תת הסוגים מבדילים בין סוגי הסרטן , נתונים אלו יכולים להוות מידע מבוסס למחקר ביולוגי ע"מ לבדוק האם ה miRNAs יכולים לאפיין פרופיל של סוג הסרטן. כהמשך למחקר זה, ניתן יהיה לבדוק את רשימת ה novel miRNAs שהתקבלו ולבחון את אתרי המטרה שלהם ואת הקשר שלהם לסוג הסרטן. miRNAs אלו יכולים לשמש כמרקרים , אם ימצאו כמשפיעים על סוג הסרטן, וכן כאמצעי לבחירת טיפול מתאים לחולות

תודה על ההקשבה תודה ל: ד"ר סול עפרוני מוריה כהן