(VĪRUSI UN ĀRPUSHROMOSOMU ĢENĒTISKIE ELEMENTI) VIRUSOLOĢIJA (VĪRUSI UN ĀRPUSHROMOSOMU ĢENĒTISKIE ELEMENTI) PĒTĪŠANAS METODES

IMUNOLOĢISKĀS METODES Vispārīgs priekšstats par imūnās aizsardzības sistēmu un imūnās atbildes veidošanos

Paul Ehrich Илья Мечников IMUNOLOĢIJAS PAMATLICĒJI Paul Ehrich Илья Мечников (1854. - 1915.) (1845. - 1916.) Humorālā un šūnu imunitāte, imunoloģijas sākums NP - 1908.g.

Jules Bordet (1870.-1961.) Antivielas, komplements NP - 1919.g. IMUNOLOĢIJAS PAMATLICĒJI Jules Bordet (1870.-1961.) Antivielas, komplements NP - 1919.g.

Galvenie imūnās sistēmas orgāni: Sarkanās kaulu smadzenes (mieloīdā sistēma) Liesa Tīmuss Limfmezgli: embrionālie (germinālie) centri (limfoīdā sistēma) Galvenās imūnās šūnas: Retikuloendoteliālās sistēmas šūnas (PMNC, mononukleārie fagocīti) Limfocīti

(spēja atšķirt savējo no sveša, svešo iznīcināt) Organisma imunitāte (spēja atšķirt savējo no sveša, svešo iznīcināt) Nespecifiskā imunitāte Specifiskā imunitāte Komplements, interferons Fagocitoze Šūnu imunitāte Humorālā (seruma) imunitāte

Nespecifiskās imunitāte Nespecifiskās rezistences mehānismi pH Lizocīms u.c. enzīmi Komplements Interferons 1. Fiziskās barjeras 2. Bioķīmiskās barjeras 3. Bioloģiskās barjeras Akūtās fāzes reakcija; Fagocitoze, Mikroflora

Vīrusu inficētie leikocīti izstrādā speciālu nelielu (~20 kD) olbaltumvielu, INTERFERONU, maisījumu, kas padara citas šūnas neuzņēmīgas pret vīrusu uzbrukumu

IFN-α gēniem nav intronu Dzīvnieku šūnu producētie interferona proteīni ir glikozilēti

Komplements Ap 20 asins plazmas proteīnu komplekss (5% asins plazmas proteīnu masas), kas aktivētā veidā izraisa dažādu šūnu lizēšanu

www.uic.edu/.../bios100/lecturesf04am/lect23.htm

Iekaisuma (akūtās fāzes) reakcija Komplementa aktivēšana izraisa arī neitrofīlu migrēšanu un infekcijas vietu

Iekaisuma (akūtās fāzes) reakcija

Fagocitoze Opsonizācija: baktēriju un citu šūnu fagocitozes veicināšana, pīesaistot to virsmai asins seruma proteīnus vai citas makromolekulas, piem.: polisaharīdus

FAGOCITOZES PROCESS

Oksidatīvais (elpošanas) sprādziens FAGOCITOZES POSMI Baktēriju piesaistīšanās pie membrānu pseidopodijām Baktēriju ieslēgšana fagosomā Fagosomas un lizosomas saplūšana Baktēriju noārdīšana Atkritumu izvadīšana Oksidatīvais (elpošanas) sprādziens

Oksidatīvais (elpošanas) sprādziens TNF (audzēju nekrozes faktora) un fMLPR ( formilpeptīdu) recoptori dod signālu fagocītiskās oksidāzes (Phox, NADPH oksidāzes) kompleksam, kas veido aktīvā skābekļa (O2-) jonus

(spēja atšķirt savējo no sveša, svešo iznīcināt) Organisma imunitāte (spēja atšķirt savējo no sveša, svešo iznīcināt) Nespecifiskā imunitāte Specifiskā imunitāte Komplements Fagocitoze Šūnu imunitāte Humorālā (seruma) imunitāte

Humorālā imunitāte Imunoglobulīnu relatīvais izmērs

Humorālā imunitāte ANTIVIELAS Imunoglobulīnu struktūra

Humorālā imunitāte ANTIVIELAS Imunoglobulīnu struktūra (IgG)

Humorālā imunitāte ANTIVIELAS Imunoglobulīni

Antigēna un antivielas mijiedarbība šķīdumā Humorālā imunitāte Antigēna un antivielas mijiedarbība šķīdumā ANTIGĒNS Antigēni - proteīni, polosaharīdi, nukleīnskābes, to kompleksi. Imunogenitāte

Humorālā imunitāte HAPTĒNS Neliela molekula, kas spēj izraisīt antivielu veidošanos tad, ja piesaistīta polimērai struktūrai Digitoksigenīns

IMUNOLOĢIJAS KLASIĶI                                 Frenks M. Burne (1899.-1985.) Imūnā tolerance, antivielu producējošo šūnu klonālās selekcijas teorija NP - 1960.g. Nils Jerne (1911.-1994.) Antivielu producējošo šūnu klonālās selekcijas teorija NP - 1984.g.

KLONĀLĀS SELEKCIJAS TEORIJA Lai veidotos specifiskā imūnā atbilde, antigēnu (Ag) jāatpazīst. Ag atpazīšana notiek tam saistoties ar īpašiem receptoriem. Ag atpazīšana ir saistīta ar starpšūnu mijiedarbību. Starpšūnu mijiedarbību kontrolē saistīšanās ar MHC (Major Histocompatibility Complex) proteīniem -receptoriem

KLONĀLĀS SELEKCIJAS TEORIJA Katrs B limfocīts nes unikālu antigēna (Ag) receptoru Saskarsme ar molekulu, kura spēj stingri saistīt receptoru izraisa attiecīgā limfocīta aktivāciju Diferencētās efektoršūnas, kuras rodas no aktivētā limfocīta, nes tādus pašus receptorus, kā sākotnējais limfocīts. Limfocīti, kuri nes receptorus pret paša organisma molekulām, tiek iznīcināti agrīnās attīstības stadijās

Humorālā imunitāte: klonālās selekcijas teorija Katrs limfocīts nes unikālu receptoru: antivielas priekšteci, kas radies imunoglobulīnu gēnu rekombinācijas un splaisinga rezultātā. Iespējamas pavisam 7500 (150 V gēni x 5 J gēni un ap 10 variantu kā savienot V un J) imunoglobulīnu vieglās ķēdes variantu; 2,4 miljonu (80 V gēni x 50 D gēni x 6 J gēni un ap 100 savienošanas versiju) smagās ķēdes variantu. Antivielu iespējamā daudzveidība: 7500 x 2 400 000 ~ 18 miljardi variantu

Humorālā imunitāte: klonālās selekcijas teorija

Humorālā imunitāte ANTIGĒNA PREZENTĀCIJA MHC II struktūra

Humorālā imunitāte

Humorālā imunitāte

Humorālā imunitāte ANTIVIELAS Imunoglobulīnu tipi

Humorālās imunitātes veidošanās

Humorālās imunitātes veidošanās Adjuvanti: vielas, kas pastiprina antivielu veidošanos pret citiem antigēniem Freinda adjuvants: BCG (Bacillus Calmet - Gerain) Lanolīneļla

www.uic.edu/.../bios100/lecturesf04am/lect23.htm

Antivielu veidotos imūnos kompleksus jāiznīcina Komplementa aktivācijas klasiskais ceļš: kompleksa proteīni izveido kanālus ar imunoglobulīniem (antivielām) iezīmētu šūnu apvalkos / membrānās. Šūnas iet bojā.

Komplements

Komplements

Antigēnu un antivielu mijiedarbība Precipitācija

Antigēnu un antivielu mijiedarbība Precipitācija

Antigēnu un antivielu mijiedarbība Precipitācija

Antigēnu un antivielu mijiedarbība Precipitācija

Antigēnu un antivielu mijiedarbība Precipitācija Dubultā radiālā imunodifūzija pēc Ohterlouni http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/thumb/f/f0/Ouchterlony_Double_Diffusion.JPG/18

Antigēnu un antivielu mijiedarbība Precipitācija Dubultā radiālā imunodifūzija pēc Ohterlouni

Antigēnu un antivielu mijiedarbība Precipitācija Dubultā radiālā imunodifūzija pēc Ohterlouni

Vīrusu un antivielu mijiedarbība Neitralizācija

Antigēnu un antivielu mijiedarbība Aglutinācija

Vīrusu un eritrocītu mijiedarbība Hemaglutinācija

Vīrusu un eritrocītu mijiedarbība Hemaglutinācija

Vīrusu un eritrocītu mijiedarbība antivielu klātbūtnē Hemaglutinācijas inhibīcija

Vīrusu un eritrocītu mijiedarbība Hemadsorbcija

Komplementa atkarīgas hemolīzes reakcijas Hemolīzes sistēma = eritrocīti + specifiski Ag

Komplementa atkarīgas hemolīzes reakcijas

Vīrusu un modificētu antivielu mijiedarbība Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Enzyme immuno assay (EIA) Imobilizēti reakcijas komponenti Vairākkārtīgas mijiedarbības (desmaizes princips) Modificētas (konjugētas) antivielas

Avidīna (streptavidīna, neiravidīna) / biotīna mijiedarbība Biotīns (vitamīns H) Avidīns (proteīns) ar 4 biotīna saistības vietām Signāla amplifikācija biotīna/avidīna mijiedarbībā https://www.thermofisher.com

Avidīna / biotīna mijiedarbība http://www.vectorlabs.com/data/descriptions/images/descr_970_Page7.gif

Vīrusu un modificētu antivielu mijiedarbība Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Enzyme immuno assay (EIA) E - sārmainā fosfatāze S - p-nitrofenilfosfāts

Vīrusu un modificētu antivielu mijiedarbība Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Enzyme immuno assay (EIA) E - sārmainā fosfatāze S - p-nitrofenilfosfāts

Vīrusu un modificētu antivielu mijiedarbība Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Enzyme immuno assay (EIA) E - sārmainā fosfatāze S - p-nitrofenilfosfāts

Vīrusu un modificētu antivielu mijiedarbība Radio-immuno assay (RIA)

Vīrusu un modificētu antivielu mijiedarbība Imūncitoķīmija un imūnhistoķīmija Tiešā un netiešā imunofluorescence Staphylococcus aureus A proteīns

Laterālās kapilārās plūsmas metode (ELISA modifikācija indikatorpapīru veidā)

Pārtikas vīrusu identificēšana inficētajā personā Rotavīrusu un adenovīrusu antigēns 5,26 EUR Norovīrusa antigēns 8,58 EUR © Centrālā laboratorija SIA © E. Gulbja laboratorija SIA www.corisbio.com

Histoloģija un imūnhistoķīmija Histopathologic changes associated with rabies encephalitis by Hematoxilline&Eosine stain. Negri bodies are cellular inclusions found in the pyramidal cells of Ammon's horn, and the Purkinje cells of the cerebellum. http://aapredbook.aappublications.org/site/week/107_11.jpg A rabies-infected neuronal cell with intracytoplasmic inclusions. The red stain indicates areas of rabies viral antigen by using IHC or avidin-biotin complex technique. http://www.cdc.gov/rabies/images/infected_neuronal.jpg

Imūncitoķīmija un imūnhistoķīmija Tiešā un netiešā imunofluorescence BK vīrusa imūncitoķīmiska krāsošana hemorāģiska cistīta pacienta urīna šūnās Zairas Ebolas vīrusa antigēna imūncitoķīmiska krāsošana inficētas cūkas plaušu šūnās http://cid.oxfordjournals.org/content/35/3/326/F3.medium.gif http://jid.oxfordjournals.org/content/early/2011/05/12/infdis.jir077/F3.medium.gif

Vīrusu proteīnu un modificētu antivielu mijiedarbība Western blot 1. Elektropārnese uz membrānu filtra 2. Bloķēšanas reakcija 3. Apstrāde ar vīrusspecifiskām antivielām 4. Apstrāde ar konjugētām, sugasspecifiskām antivielām 5. Attīstīšana

Vīrusu nukleīnskābju un modificētu antivielu mijiedarbība Hibrīda saistīšana

Vīrusu nukleīnskābju un modificētu antivielu mijiedarbība Hibrīda saistīšana

(spēja atšķirt savējo no sveša, svešo iznīcināt) Organisma imunitāte (spēja atšķirt savējo no sveša, svešo iznīcināt) Nespecifiskā imunitāte Specifiskā imunitāte Šūnu imunitāte Humorālā (seruma) imunitāte

IMUNOLOĢIJAS KLASIĶI Peter Doherty (1940.) Rolf Zinkernagel (1944.) Šūnu imunitātes mehānisms 1975. g., NP - 1996.g.

Šūnu imunitāte

Šūnu imunitāte ANTIGĒNA PREZENTĀCIJA MHC I struktūra

IZŠĶIROŠAIS EKSPERIMENTS

Peļu līnija “B”; Vīruss “X”; reakcijas nav No peles izolē T-citotoksiskās šūnas un audzē tās kopā ar dažādu vīrusu inficētām šūnām no dažādām peļu līnijām Peļu līnija “B”; Vīruss “X”; reakcijas nav

Peļu līnija “A”; Vīruss “Y”; reakcijas nav No peles izolē T-citotoksiskās šūnas un audzē tās kopā ar dažādu vīrusu inficētām šūnām no dažādām peļu līnijām Peļu līnija “A”; Vīruss “Y”; reakcijas nav

Peļu līnija “A”; Vīruss “X”; reakcija ir No peles izolē T-citotoksiskās šūnas un audzē tās kopā ar dažādu vīrusu inficētām šūnām no dažādām peļu līnijām Peļu līnija “A”; Vīruss “X”; reakcija ir

Apkopojot: imūno atbildi veidojošo šūnu funkcijas

Apkopojot: imūnā atbilde uz dažādiem patogēniem

IMUNOLOĢIJAS KLASIĶI Cesar Milstein (1927.) Georges Koehler (1944. - 1995.) Monoklonālo antivielu iegūšanas metode 1975. g., NP - 1984.g.

Monoklonālu antivielu iegūšana 1976., Koehler G., Milstein C. Limfocītu un mielomas šūnu hibrīdi producē Av, kas ir specifiskas vienam epitopam

Monoklonālas antivielas veidojošu hibridomu iegūšana HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) barotne; TK un HGPRT pozitīvas šūnas Aminopterīns

Fluorescence activated (assisted) cell sorting Monoklonālu antivielu izmantošana šūnu diferencēšanās pazīmju noteikšanai FACS - Fluorescence activated (assisted) cell sorting

FACS tehnoloģija

FACS tehnoloģija

FACS tehnoloģijas izmantošana Saskaitīt daļiņas suspensijā Noteikt bioloģisku materiālu no nebioloģiska Atdalīt/noteikt “dzīvās” un “nedzīvās” daļiņas Izvērtēt no 105 - 106 daļiņas vienā minūtē Sortēt atsevišķas daļiņas turpmākām analīzēm

FACS tehnoloģijas attīstība: pirmie aparāti

FACS tehnoloģijas attīstība: modernie aparāti

Luminex tehnoloģija 5,6 mm diametra lodītes (mikrosfēras) iekrāso 100 atšķirīgos toņos (10 unikālas sarkanās x 10 unikālas infrasarkanās krāsas koncentrācijas). Katru iekrāsoto mikrosfēru grupu pārklāj ar sava veida antivielām. Analizatorā ar lāzeriem identificē katru mikrosfēru grupu un, ja antiviela piesaistījusi antigēnu, tad arī papildus piesaistīto sekundāro krāsvielu. Katras mikrosfēru grupas mērījumus vairākkārtīgi atkārto, vienā paraugā iespējams vienlaikus, ātri un precīzi kvantitatīvi identificēt līdz 100 dažādus proteīnus.

Luminex tehnoloģija http://www.panomics.com/index.php?id=product_96 http://www.gamidor.com/company.asp?CompanyID=23 http://4.bp.blogspot.com/__AuwUApfRb4/S2dn-H6qviI/AAAAAAAAGSA/d2FfbxzIE_I/s400/luminex.jpg