الطريقة المستمرة لتقدير فعالية انزيم البيروكسيديز Peroxidase Third class Lab no.1 Enzymology Teacher zainab salim

نوع الانزيم واستخداماته وهو من انزيمات الاكسدة والاختزال Oxidoreductases المنتشرة في الطبيعة بشكل واسع . له استخدامات متعددة اذ يدخل في تركيب العدد التشخيصية الخاصة بتقدير الكلوكوز مشاركة مع انزيم الكلوكوز اوكسيديز . له اهمية في تقنية الاليزا ELISA المهمه في التفاعلات المناعية وغيرها . يدخل في علاج الامراض الجلدية .

Enzymes

Enzyme Reactions ENZYME SUBSTRATE PRODUCT

مصادر الانزيم المصدر الرئيس لانتاج الانزيم هو النباتات كالفجل والرشاد والالمازه وغيرها . اذ يعد الانزيم احد المراكز الدفاعية في النبات , ويوجد في الاحياء المجهرية والحليب . المادة الاساس التي يعمل عليها الانزيم هي بيروكسيد الهيدروجين H2O2 اذ يعمل على تحليلها الى اوكسجين وماء . ولتقدير فعالية الانزيم تستخدم طرق لونية تستعمل فيها مواد تعرف بانها مستقبلة للاوكسجين (O2 Acceptor ) كمادة الكواياكول (Guiacol ) وهي مادة عديمة اللون عند اضافتها الى وسط التفاعل الانزيمي تعمل على الاتحاد مع الاوكسجين المتحرر من التفاعل ليتكون معقد بني اللون هو التتراكواياكول (Tetraguiacol ) الذي يمتلك طيف موجي اعظم على طول موجي 420- 436 نانومتر.

المواد والكواشف 1- الكواياكول 0.1% H2O2 0.15% M Ph = 7 Buffer phosphate 0.1 انزيم البيروكسيديز

طريقة العمل - تمزج حجوم متساوية (1)مل من كل من: الكواياكول ,وبيروكسيد الهيدروجين ,وبفر الفوسفات . ثم يضاف (7) مل من الماء المقطر ليصبح الحجم (10)مل . ياخذ منها (3) مل لتوضع في في جهاز (Spectrophotometer ) لتصفير الجهاز على طول موجي 436 نانومتر ويعتبر هذا الوقت هو زمن الصفر لعدم وجود انزيم . بعد ذلك يتم اضافة 0.1 مل من الانزيم الى خلية الجهاز ويتم مزجها بحذر . يبدء حساب الوقت لتاخذ القراءات في الجهاز كل نصف دقيق او دقيقة واحدة لحين استقرار قراءة الجهاز .

Measuring color change with spectrophotometer – measures the amount of light that penetrates at different wavelengths

الحسابات تمثل القيم بيانياً بين الامتصاصية والزمن لنحصل على علاقة خطية كما في الرسم : علاقة خطية : نستخرج قيمة الميل Slope كما يلي: Δ A = slope الامتصاصية Δ T Δ T = التغير في الزمن = Δ A التغير في الامتصاصية الزمن

ولاستخراج فعالية انزيم البيروكسيديز نطبق القانون التالي : الفعالية (Unit/ml ) = الميل × الحجم الكلي في خلية الجهاز 3.1 حجم الانزيم × طول المسار الضوئي × ثابت النفوذية المولارية

الملاحظات 0.1× 1× 6.4 1- طول المسار الضوئي لخلية الجهاز : 1 سم 2- ثابت النفاذية المولارية للكواياكول: 6.4 -3 بناءا على المعطيات في النقطتين الاولى والثانية سيطبق قانون الفعالية كالاتي : الفعالية (Unit/ml ) = الميل × 3.1 × 1000 0.1× 1× 6.4 4- لكل انزيم تعريف خاص بالفعالية او بوحدة الفعالية يمكن من خلاله صياغة قانون الفعالية لذلك الانزيم . 5- لذا يمكن ان نعرف وحدة الفعالية لانزيم البيروكسيديز بأنها كمية الانزيم اللازمه لتحويل مايكرومولار واحد من بيروكسيد الهيدروجين H2O2 الى ناتج في دقيقه واحده تحت ظروف التفاعل .