TRANSLATSIOON JA GEENIREGULATSIOON

Transkriptsioon ja translatsioon toimuvad bakterirakus korraga, eukarüoodis aga eraldi etappidena ja erinevates kohtades

Iga mRNA molekul on samaaegselt transleeritav paljudel ribosoomidel – polüribosoomil Polüribosoomid bakteris

Ribosoomi struktuur Suur ja väike subühik 50S* ja 30S → 70S (bakterid) 60S ja 40S → (80S eukarüoodid) 50 S subühik (vastutab peptiidsidemete sünteesi ja tRNAde translokatsiooni eest): : 23S rRNA (ribozyme: peptidyltransferase enzyme) 5S rRNA 31 valku (L1,L2...L31, struktuurne roll-jäikus) 30S subühik (seob mRNAd ja initsieerib translatsiooni): 16S rRNA (translatsiooni initsiatsioon, Shine-Dalgarno komplementaarne järjestud 3´otsas, 15420 bp; määrab aa-tRNA ja mRNA koodoni vastavust ) 21 valku (S1, S2....S21) Mõlemates subühikutes on kolm saiti: A-saidis toimub aminoatsüül-tRNA seondumine. P-saidis sünteesitakse peptiidside. E-saidis seotakse vaba tRNA enne, kui see ribosoomilt vabaneb . *Svedberg units – units of sedimentation coefficient Bakterite identifitseerimine: 16S rRNA järjestus

Translatsiooni initsiatsioon TIR (translation initiation region): määrab ära translatsiooni alustamise õiget kohta (lugemis raami): Start koodonid: AUG (mõnikord GUG, väga harva UUG või AUA) RBS (ribosome binding site) või Shine-Dalgarno järjestus: AUG initsiaatorkoodonist 5-10 nt ülespoole jääv polüpuriinjärjestus konsensusega AGGAGG komplementaarne ribosoomi 16S rRNA 3´-otsa lähedal paikneva nt järjestusega (paardub sellega) translatsiooni initsiatsiooni efektiivsust mõjutab RBS-i ja initsiaatorkoodoni vaheline kaugus Osadel mRNA-del asendab RBS-i downstream box (DB), mis seondub 16 S RNA- ga teises kohas anti-DB 16 S RNA-s: 1483-AGUACUUAGUGUUUC-1469 puudub 5’UTR

Translatsiooni initsiatsioon Translatsiooni initsiatsioonil bakteris osalevad: ribosoomi 30S subühik mRNA spetsiaalne initsiaator-tRNA kolm initsiaatorfaktorit (valgud IF-1, IF-2, IF-3) GTP Enne translatsiooni toimumist on ribosoomid jaotunud kaheks alaühikuks – 30S ja 50S subühikuteks Initsiaator-tRNA: Metionüül-tRNAfMet tunneb ära initsiaator-koodoni AUG viib ribosoomi P saiti formüülmetioniini metioniini, mille aminorühm on blokeeritud formüülrühmaga GUG RNA muudes positsioonides kodeerib valiini Peptide deformylase: eemaldab formüül rühma Methionine aminopeptidase:e eemaldab N-terminaalse metioniini

Translatsiooni initsiatsiooni etapid Ribosoomi 30S subühik on seotud IF3: aitab hoida subühikud lahus IF1 seondub ribosoomi 30S subühiku A-saidiga, takistades metionüül-tRNAfMet sisenemist Ribosoomi 30S subühik ja mRNA moodustavad kompleksi. Metionüül-tRNAfMet interakteerub initsiatsiooni-faktoriga IF-2 GTP juuresolekul (uus : IF-2 GTP seondub 30S enne fMet-tRNA) Täielik initsiatsioonikompleks moodustub metionüül-tRNAfMet/IF-2/GTP ning mRNA/30S subühik/IF-3 /IF-1 komplekside kombineerumisel Metionüül-tRNAfMet ligub kohe ribosoomi peptidüül-saiti (P-saiti) ja seondub antikoodoniga initsiaatorkoodonile AUG mRNA molekulil Enne 50S subühiku lisandumist vabanevad IF-1 ja IF-3 50S subühiku liitumisel 30S subühikuga tarbitakse GTP energiat ning kompleksist vabanevad IF-2 ja GDP AUG kõrval asuv koodon ribosoomi A-saidis on valmis vastu võtma aminoatsüül-tRNA molekuli, mis sisaldab sellele koodonile vastavat antikoodonit P- peptidyl binding site A- aminoacyl binding site E- exit site

Translatsiooni elongatsioon aminoatsüül-tRNA-d seonduvad EF-Tu (elongation factor Tu) ja GTP juuresolekul sattuvad A-saiti. Koodoni-antikoodoni komplementaarsus. EF-Tu stabiliseerib seondumist A-saidga hüdrolüüsides GTP→GDP ning see järel vabaneb Peptidüültransferaasi reaktsioon (23S RNA): toimub peptiidsideme moodustumine amiinohappe (A-sait) ja peptiidi (P-sait) vahel =>kasvav peptiid ülekandub A-saitis olevale tRNA-le EF-G (elongation factor G) =translokaas siseneb ribosoomi ja paigutab peptiid-tRNA A-saidist P-saiti kasutades GTP→GDP energiat. mRNA säilitab kontakti tRNA-ga, liikudes läbi ribosoomi Translatsiooni elongatsiooni kiirus: 15-20 aminohapet/s

Translatsiooni terminatsioon Stoppkoodonid (stop or nonsense codons): UAA, UAG, UGA Translation release factors: RF1 (UAA, UAG) and RF2 (UAA, UGA) Sisenevad A saiti RF1/RF2 + EF-G + RRF (ribosome release factor): lõigatakse polüpeptiid tRNA-lt lahti RF3 vabastab RF1 ja RF2 ribosoomilt Ribosoomi jaotumine, IF3 seondub 30S sunühikuga Translatsiooni takerdumine mRNA lõppeb ilma stoppkoodonita (nt. osaline degradatsioon) tmRNA (transfer-messenger RNA): tRNA ja mRNA funktsioonid Alaniin ribosoom liigub mRNA-lt tmRNA-le: 10 ORF + stoppkoodon Kodeerib osa “märklaua järjestus” mida tuneb ära Clp proteaas

Bakterite operonide struktuur ja ekspressioon Transcription start site spacer -90 -35 -10 +1 DNA core promoter operator RBS (S-D) AUG UAA AUG UAG mRNA (polycistronic) TIR 3´UTR polypeptide 1 polypeptide 2 5´UTR Bakteriaalne mRNA on reeglina polütsistroonne, st. üks mRNA kodeerib mitut valku  5’ UTR- untranslated region (leader sequence)

Bakterite operonide struktuur ja ekspressioon Transcription start site spacer -90 -35 -10 +1 DNA core promoter operator RBS (S-D) AUG UAA AUG UAG mRNA (polycistronic) TIR 3´UTR polypeptide 1 polypeptide 2 5´UTR Osade polütsistroonsete mRNA-de puhul paiknevad aga geenid nii lähestikku, et lõppeva geeni stop koodon ja temale järgneva geeni initsiaatorkoodon asuvad kõrvuti või kattuvalt. Sel juhul ei dissotsieeru ribosoomi 30S subühik pärast stopp koodonit mRNA-lt, vaid difundeerub külgneva geeni initsiaatorkoodonini ning alustab järgmise polüpeptiidi sünteesi

Translational coupling: geeni translatsiooni efektiivsuse sõltuvus samal polütsistroonsel mRNA-l upstream asuva geeni translatsioonist ühe geeni stop koodon ja temale järgneva geeni initsiaatorkoodon asuvad kõrvuti või kattuvalt – ribosoomi 30S ühik ei dissotseeru mRNA-lt vaid alustavad järgmise polüpeptiidi sünteesi- translational coupling via reinitiation

Geeniregulatsioon bakterirakus: Translatsioon DNA Gene copy number Promoter activity Transcription Induction/repression Attenuation RNA Stability of mRNA Ribosome binding Translation Codon usage Protein Protein stability Folding (many factors) Post-translational modifications Protein structure and modification Enzyme activity Inhibition/ activation

Translatsiooni regulatsioon läbi RBS-i ja initsiaatorkoodoni blokeerimise või aktivatsiooni RBS-i maskeeriv sekundaarstruktuur tekib mRNA enda järjestuse baasil. Selle struktuuri destabiliseerimine: - antisens RNA komplementaarne RBS upstream külgneva alaga (small regulatory RNA) - regulatoorse valgu seondumine RBS upstream külgneva alaga - keskkonna To muutmine (tõstmine) Inhibitsioon - RBS-i sisaldava alaga paardub komplementaarne antisens RNA - translatsiooni initsiatsioonisaiti seondub spetsiifiline repressorvalk Aktivatsioon Inhibitsioon

Translatsiooni pärssimine regulatoorsete RNAde abil OmpC ja OmpF on põhilised poriinivalgud bakteri välimises rakumembraanis Väliskeskkonna madala osmolaarsuse korral on ülekaalus OmpF poorid (suuremad poorid), kõrge osmolaarsuse korral (nt. inimese soolestik) aga OmpC poorid (väiksemad) OmpF hulka vähendatakse kõrge osmolaaruse tingimustes antisense RNA micF abil. micF RNA (93 nucl.) paardub ompF mRNA RBS-i ja initsiaatorkoodonit AUG sisaldava alaga, blokeerides ompF geeni translatsiooni micF RNA ekspressioonitase on rakus maksimaalne kõrge osmootse rõhu korral (samuti kõrge T, pH)

Translatsiooni pärssimine regulatoorsete RNAde abil Translatsiooni inhibeerime plasmiidide replikatsiooni kontrolli käigus - Plasmiidi R1 replikatsiooni initsiaatorvalgu RepA mRNA liiderjärjestusega seondub antisense RNA copA (91 nt) Rep A valgu RBS on blokeeritud, translatsioon ei toimu ja plasmidi replikatsioon on pärsitud- plasmiidi koopiarvu kontroll RepA mRNA ja antisense RNA copA dupleksi degradatsiooni alustab endonukleaas RNAase E, polü(A)polümeraas PAPI lisab polü(A) järjestuse 3’ otstese, mis hõlbustab RNA dupleksi degradatsiooni RNase II ja PNPase poolt Tagab kiire kohanemisvõime keskkonna muutuvatele tingimustele

Translatsiooni regulatsioon repressorvalgu seondumise kaudu Translatsiooni initsiatsioonisaiti või selle lähedale seondub spetsiifiline regulaatorvalk Ribosoomivalkude operonid- R-valgud, kodeeritud rps ja rpl geenide poolt Üks reguleeritava operoni poolt kodeeritud valkudest seondub vastava polütsistroonse mRNA spetsiifilisele järjestusele, mis külgneb RBS-iga ja sisaldab AUG koodonit Kui rakud kasvavad kiiresti, on rakusisene rRNA hulk kõrge ja regulatoorsed R-valgud seonduvad rRNA-ga, kuna nende seondumisafiinsus rRNA-le on kõrgem kui mRNA-le Translatsiooni repressioon toimub vaid siis, kui kogu rRNA on valkudega seostunud ning lisasünteesi tarvis ei ole.

- RBS-i maskeeriv sekundaarstruktuur tekib mRNA enda järjestuse baasil Translatsiooni aktivatsioon RBS-i maskeeriva sekundaarstruktuuri destabiliseerimise kaudu - RBS-i maskeeriv sekundaarstruktuur tekib mRNA enda järjestuse baasil - RBSi maskeeriv mRNA sekundaarstruktuur võib teatud tingimustes destabiliseeruda. - Kuumashoki sigma faktori RpoH (s32) mRNA muutub transleeritavaks kõrgemal temperatuuril: selle RBSiga kattuv sekundaarstruktuur mRNAs on madalamatel temperatuuridel stabiilses konformatsioonis, takistades translatsiooni. Kõrgematel temperatuuridel pakkub mRNA lahti, ribosoom seondub ja translatsioon saab toimuda = RNA thermosensors

Translatsiooni aktivatsioon regulatoorsete RNAde abil rpoS – statsionaarse faasi ja üldine stressi sigma faktor ss(s38) rpoS mRNA DsrA RNA Hfq protein - RBS-i maskeeriv sekundaarstruktuur tekib rpoS mRNA enda järjestuse baasil. Sekundaarstruktuuri tunneb ära ja lõikab endoribonukleaas RNase III ja seejärel RNaseE – mRNA degradatsioon - DsrA on antisens RNA (87 nt) komplementaarne rpoS mRNA 5’ liider järjestusega. Nende RNA-de omavaheline paardumine muudab rpoS RBS ja initsiaatorkoodoni ribosoomidele kättesaadavaks. Hfq valk aitab rpoS mRNA ja DsrA vahelist paardumist. RNase III lõikab rpoS-DsrA dupleksi dsrA ekspressiooni tase tõuseb osmootse šoki ja madala T korral DsrA on H-NS (histone-like nucleoid-structuring protein) translatsiooni negatiivne regulaator

Translatsiooni initsiatsiooni regulatsioon alternatiivsete sekundaarstruktuuride abil – translatsiooniline attenuatsioon Erütromütsiin: antibiootikum, translatsiooni inhibiitor, toimib läbi seondumise ribosoomi suurele subühikule (peptidyltransferase loop) Staphylococcus aureus’e resistentsus erütromütsiini suhtes tekib tänu RNA metülaasile (erm), mis dimetüleerib 23S rRNAs adeniini 2058 (paikneb peptidüültransferaasi aktiivsusega järjestuses) – erütromütsiin seondumine ribosoomiga ei ole stabiilne. Selle tulemusena muutub bakter resistentseks väga kõrgetele erütromütsiini kontsentratsioonidele Erütromütsiini madalad kontsentratsioonid toimivad RNA metülaasi translatsiooni induktorina Erütromütsiini puudumisel liiderpeptiidi järjestus RNA metülasi (erm) mRNA-s moodustab sekundaar- struktuure 1:2 ja 3:4 vahel. Regioonide 3 ja 4 paardumise tagajärjel on erm RBS ja initsiaatorkoodon ribosoomidele kättesaamatud Erm geen kandub plasmiididel ja transposonidel. Mutatsioonid A2058 ja selle ümbruses samuti tekkitavad resistentsust Expression of MLSB resistance can be constitutive or inducible. In inducible resistance, the bacteria produce inactive mRNA that is unable to encode methylase. The mRNA becomes active only in the presence of a macrolide inducer. By contrast, in constitutive expression, active methylase mRNA is produced in the absence of an inducer. Induction is related to the presence of an attenuator upstream from the structural erm gene for the methylase. Induction occurs posttranscriptionally, according to the model of translation attenuation in the case of the erm(C) (a staphylococcal determinant) and also probably in the case of the erm(A) and erm(B) determinants [6]. The presence of an inducer leads to rearrangements of mRNA, which allow ribosomes to translate the methylase coding sequence. The erythromycin-ribosome complex, in turn, makes its presence felt during induction by inhibiting translation of a 19-amino-acid peptide encoded by the 141-nucleotide leader sequence of the ermC message extending from the transcription initiation site to the methylase initiator Met codon. Erütromütsiini madalatel kontsentratsioonidel translatsioon ei ole inhibeeritud, kuid ribosoom peatub liiderpeptiidi 9-ndal koodonil AUC ( ribosome stalling) ja takistab 1:2 paardumist Regioon 2 paardub regiooniga 3 ning erm geeni translatsiooni pärssivat sekundaarstruktuuri ei moodustu

Transkriptsiooni attenuatsioon transkriptsiooni regulatsioon m-RNA sekundaarsete struktuuride abil, millel on enneaegsete terminaatorite või antiterminaatorite funktsioon toimub spetsiifilistel liiderpeptiidi kodeerivatel järjestustel, millel on potentsiaal moodustada alternatiivseid RNA sekundaarstruktuure, mis toimivad kas terminaatorina või antiterminaatorina P/O - trp operoni transkriptsioon E. coli (biosüntees) sekundaarstruktuuride moodustumine 1-2 ja 3-4 (terminator) või 2-3 pöördkorduv järjestuste vahel alternatiivsete sekundaarstruktuuride teke on mõjutatud liider-RNA translatsiooni kiirusest Järjestuses 1 on mitu trüptofaani koodonit

Translational coupling: geeni translatsiooni efektiivsuse sõltuvus samal polütsistroonsel mRNA-l upstream asuva geeni translatsioonist ühe geeni stop koodon ja temale järgneva geeni initsiaatorkoodon asuvad kõrvuti või kattuvalt – ribosoomi 30S ühik ei dissotseeru mRNA-lt vaid alustavad järgmise polüpeptiidi sünteesi- translational coupling via reinitiation translatsiooni initsiatsiooni pärssiva sekundaarstruktuuri kadumine- translational coupling via opening of the RBS by translation of preceding cistron

Riboswitches Cotranscribed RNA elements that modulate expression of mRNA Directly recognize a physiological signal cellular metabolite Global regulators (ppGpp) Metals ions T oC tRNAs Control transcriptional attenuation or translation initiation

Geeniregulatsioon bakterirakus: Translatsioon DNA Gene copy number Promoter activity Transcription Induction/repression Attenuation RNA Stability of mRNA Ribosome binding Translation Elongation, termination Codon usage Protein Protein stability Folding (many factors) Post-translational modifications Protein structure and modification Enzyme activity Inhibition/ activation

Lugemisraami nihkumine translatsioonil Lugemisraami nihkumine toimub kohtades, kus translatsiooni elongatsioon korraks peatub, andes ribosoomile võimaluse mRNA-l libiseda 5’ suunas 1 nukleotiidi võrra (-1 raamnihe) Raaminihke toimumist soodustab: - RNA sekundaarstruktuur (ribosoomi peatumine) - Korduvad nukleotiidid (X-XXY-YYZ , slippery heptameer).

Lugemisraami nihkumine translatsioonil Lugemisraami nihkumine dnaX geeni translatsioonil Bakteris E. coli kodeerib DNA polümeraasi III tau ja gamma subühikuid dnaX geen Tau subühik – 643-st aminohapet Gamma subühik – 431 aminohapet, translatsioon termineeritud teises lugemisraamis asuva stop koodoni poolt Positsioonides 428 – 432 asuvates koodonites sisaldub 6 järjestikust adeniini ning seejärel raamis –1 järjestus UGA (stoppkoodon) - 1 raaminihe tekib A-järjestustel kõrge sagedusega: gamma ja tau subühikute suhe on bakterirakus 1:4 Raaminihet soodustab mRNA-s UGA koodonile järgnev juuksenõelastruktuur (polümeraasi kokkupanek DNA-l)

Lugemisraami nihkumine translatsioonil Lugemisraami nihkumine IS3 elemendi transposaasi translatsioonil IS3 elemendi aktiivse transposaasi sünteesiks on tarvis teineteisega kattuvaid ORFA ja ORFB. Vaid siis, kui toimub –1 raaminihe, ületatakse ORFA-so olev stop-koodon sellega, et translatsioon liigub ORFB-le

Geeniregulatsioon bakterirakus: Translatsioon DNA Gene copy number Promoter activity Transcription Induction/repression Attenuation RNA Stability of mRNA Ribosome binding Translation Elongation, termination Codon usage Protein Protein stability Folding (many factors) Post-translational modifications Protein structure and modification Enzyme activity Inhibition/ activation

Translatsiooni efektiivsus sõltub koodonkasutusest -Sama aminohapet kodeerivad mitmed koodonid (v. a. Met ja Trp) - Sünonüümkoodoneid kasutatakse erineva sagedusega erinevates organismides ja liigisiseselt erinevates geenides - codon bias (koodonkasutus) Erinevate liikide genoomis on G + C sisaldus erinev Pseudomonas putida G+C sisaldus on 62%, Bacillus subtilis – 43% Raskendab geenide heteroloogilist avaldumist

Translatsiooni efektiivsus sõltub koodonkasutusest koodoni kasutamise sagedus sõltub vastava tRNA hulgast rakus hulgaliselt aruldasi koodoneid sisaldavate geenide ekspressiooni tase on madalam/aeglasem funktsionaalselt seotud geenid sarnase ekspressioonitasemega omavad sarnast koodonkasutust koodonkasutus mõjutab mRNA sekundaarseid struktuure - 5’-otsas sekundaarsed struktuurid vähendavad geeni ekspressiooni (initsiatsioon, kättesaadavus RNasidel) - mõjutavad ribosoomi kiirust (pausid on vajalikud valkude pakkimiseks) koodonkasutus mõjutab translatsiooni täpsust (harva esinenevatesse koodonitesse sagedamini siseneb tRNA, mille antikoodon erineb 1 nukleotiidi võrra) koodonkasutus sõltub keskkonnatingimustes - tRNA modifikatsioon (üle 100 modifikatsiooni)

Geeniregulatsioon bakterirakus: valgu tasemel DNA Gene copy number Promoter activity Transcription Induction/repression Attenuation RNA Stability of mRNA Ribosome binding Translation Elongation, termination Codon usage Protein Protein stability Folding (many factors) Post-translational modifications Protein structure and modification Enzyme activity Inhibition/ activation

Posttranslatsiooniline regulatsioon kiirendab rakkude adapteerumist muutunud keskkonnatingimustega Kontrollmehhanismid toimivad : valkude pakkimine (folding):osalevad chaperonid (nt. denatureeritud kuumašoki valgud) ensüümide aktiivsuse mittekovalentse moduleerimine (allosteeriline regulatsioon) tagasisidestuslik inhibitsioon (feedback inhibition) valkude kovalentne modifitseerimine (enamasti fosforüleerimine) signaalse transduktsiooni rajad (sensorvalgu autofosforüleerimine) kemotaksis (retseptorvalgu metülatsioon) ensüümide aktiivsus (glutamiin süntetaas) proteolüüs E. coli 20 endoproteaasi, “housekeeping” või regulatoorne funktsioon (ühe rakupõlvkonna vältel degradeeritakse 20% valkudest) individuaalsete valkude poolestusaeg rakus väga erinev (<1tund-3 päeva) valkude allumine proteolüütilisele degradatsioonile sõltub märkimisväärselt rakkude kasvutingimustest (15% versus 50% alla 5 tunni exp. ja nälgivas kultuuris) Lon ja Clp (teostavad 60% valkude degradatsiooni) ATP-sõltuvad proteaasid degradeerivad valke, mis on denatureerunud heat shock tulemusena Lon proteaas degradeerib SulA regulatoorset valku (SOS cell division inhibitor)

Posttranslatsiooniline regulatsioon: tagasisidestuslik inhibitsioon Trüptofaani operoni negatiivne regulatsioon 3 tasandil: repressioon (TrpR – apporepressor, trüptofaan - korepressor) transkriptsiooni attenuatsioon tagasisidestuslik inhibitsioon chorismic acid → tryptophan anthranilate synthase (heterotetrameer TrpE ja TrpD)- biosünteetilise raja 1 ensüüm üleliigne rakusisene trüptofaan seondub TrpE ja inaktiveerib ensüümi

Posttranslatsiooniline regulatsioon: ensüümide aktiivsus valkude kovalentne modifitseerimine glutamiin süntetaas (lämmastiku metabolism): glutamaat →glutamiin Glutamiin süntetaas adenoribosüleeritakse (AMP lisamine türosin aa, adenülüültransferaas) glutamiini kõrgetel kontsentratsioonidel => ensüümi aktiivsus langeb