تشخیص آزمایشگاهی بیماری سل روش مستقیم Direct smear

آزمايش ميكروسكوپي (مستقيم)

مقدمه : سل یک بیماری عفونی مزمن است که دراثرباکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس بوجود می آید.عامل این بیماری درسال 1882توسط رابرت کخ کشف گردید. تاریخ بیماری سل رامی توان باقدمت بشریت برابردانست.به این بیماری طاعون سفید نیز اطلاق شده ودرکتب غربی به این بیماری توبرکلوز(tuberculosis) و به اختصارTBاطلاق می -گردد.درحال حاضرحدود2میلیاردنفرآلوده به میکرب سل و20میلیون نفرمبتلابه بیماری سل هستند.

سازمان بهداشت جهانی تخمین می زند که بیش از نیمی از جمعیت جهان با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس آلوده می گردندوسالیانه حدود 3میلیون نفریا بیشترجان خود را ازدست می دهند. از سال 1990،تعداد مبتلایان به سل افزایش یافته است که سالانه بین 20هزار و 30 هزار مورد جدید سل شناسایی می گردند.

علایم بیماری سل تب سرفه پایداربیش ازدوهفته همراه باخلط وگاهی خلط خونی درد قفسه سینه تنگی نفس کاهش وزن بی اشتهایی بی حالی،خستگی وعرق شبانه

راه سرایت بیماری بیشترین راه انتقال ازراه دستگاه تنفس است ،فردبیماربه هنگام سرفه ،خنده وعطسه قطرات ریزی رادرهوای اطراف منتشرمی کندکه به سرعت درهواخشک شده وبه صورت ذرات ریزحاوی باسیل تاچندین ساعت معلق می مانند و به آلوئولهای ریه شخص سالم که هوای آلوده واجد قطرات راتنفس می کنندراه یافته وپس ازاستقراروتکثیرایجادعفونت می کنند.افرادی که با بیماران سل ریوی درنواحی با تهویه نامناسب ارتباط دارند در خطر بالای آلودگی می باشند.بیمارانی که مایکوباکتریوم را دفع می کنند حدود 29 درصد از تماس- های نزدیک شان را آلوده می سازند.

خصوصیات باسیل سل mycobacterium tuberculosis ارگانیسم های خمیده یا مستقیم به طول 10-1وعرض 6/0-2/0mm غیرمتحرک بوده ،تولید اسپور نمی نمایند. گرم مثبت ضعیف . دیواره سلولی این باکتری درصد قابل توجهی چربی دارد ،بنابراین دربرابررنگ پذ یری از خود مقاومت نشان می دهد. اجزای ساختمانی وفراورده های کمپلکس دیواره سلولی عامل ویرولانس بیماری وتوانایی بقاءدرشرایط محیطی سخت می باشد. پس از رنگ شدن با کمک حرارت ،درمقابل رنگبری اسید کلریدریک 3 درصد و یا اتانول 95 درصدمقاومت نشان می دهند. هوازی اجباری بوده وکند رشد می باشند.بیشترمایکوباکتریهای بیماریزادرمدت 6-2 هفته در شرایط و محیط مناسب رشد می کنند. رشد مایکوباکتریوم توبرکلوزیس تحت شرایط 10-5 درصد دی اکسید کربن وPHخنثی وحضورگلیسرین بهترانجام می گیرد.

تشخیص باسیل سل روش مستقیم تشخیص باسیل سل روش مستقیم سریعترین وارزانترین راه تشخیص باسیل سل ،آزمایش لام مستقیم می باشدوباید روی تمام موارد مشکوک به سل انجام گیرد. با این روش ،فقط می توان سل ریوی با خلط مثبت را شناسایی کرد. برای مشاهده باسیل اسیدفست درلام،بایددریک میلی لیترازخلط تعداد 10000-5000باسیل سل وجود داشته باشد. نمونه باید به روش صحیح گرفته شودیعنی بایدازموادترشحی ریه ها پس ازیک سرفه عمیق تهیه گردد.نمونه هایی که ازحلق یابینی تهیه می شود،مناسب نیستند..درمواردی که نمونه آب دهان است بایستی موردآزمایش قرارگیرد اما آموزش های لازم به بیمارداده شود.

آزمايش ميكروسكوپي رنگ آميزي با: ذيل – نلسون : رنگ قرمز نکات مهم: عدم استفاده از رنگهاي آماده عدم استفاده از سواپ پنبه دار درتهیه گسترش گزارش به روش استاندارد

آماده سازي نمونه ها لام های نو به کار گرفته شود. شماره لام دریک سوم انتهایی لام نوشته شود . گسترش در2/3فوقانی تهیه گردد. استفاده فقط يك بار از هر لام انتقال ظروف خلط به هود ايمني براي جلوگيري از بوجود آمدن آئروسل ها، ظروف را با نهايت دقت باز مي كنند. تهيه يك گسترش منظم و يكسان در روي لام در2/3فوقانی لام

براي تهيه گسترش، بهتر است از لوپ پلاستيكي يك بار مصرف يا اپليكاتور چوبي دو نيم شده استفاده شود تا احتمال آلودگي محيط به حداقل برسد. گسترش ها در داخل هود ايمني به آرامي خشك شوند. نگهداري نمونه خلط تا گزارش نتيجه .

خيلي كوچك، خيلي بزرگ، خيلي كلفت، خيلي نازك، نامشخص و نامنظم گسترش ايجاد شده : بايد در وسط به اندازه كافي بزرگ نبايد: خيلي كوچك، خيلي بزرگ، خيلي كلفت، خيلي نازك، نامشخص و نامنظم

فرمول تهيه رنگ ذيل _ نلسون الف) محلول فوشين بازيك، 0.3 گرم از فوشين بازيك را در ml 10 اتانول 95 % حل مي كنند. Basic fuchsin 0.3 g Ethanol 95% 10 ml ب) محلول فنل، مقدار 5 گرم از فنل كريستاله را كمي گرم مي كنند تا ذوب شود. سپس با اضافه كردن آب مقطر حجم نهايي آن را به ml90 مي رسانند. Phenol crystals 5 g Distilled water 90 ml براي تهيه محلول كربول فوشين، مقدار ml 10 از محلول فوشين بازيك را به ml 90 از محلول فنل اضافه مي نمايند. 2- محلول رنگ بر براي آماده كردن اسيد الكل 3 % ، ml 3 از اسيد كلريدريك غليظ را در ml 97 از اتانول حل مي كنند. Ethanol 95% 97 ml HCl 3 ml به آرامي اسيد را به ظرف الكل اضافه مي نمايند. براي رنگ بري مي توان از اسيد سولفوريك 25 % نيز استفاده كرد ( ml25 اسيد + ml75 آب مقطر). محلول رنگ آميزي زمينه 0.3 گرم از آبي متيلن را در ml100 آب مقطر حل مي كنند. Methylene blue 0.3 g Distilled water 100 ml

ثابت كردن گسترش روي لام يا 3 بار در روي شعله یادرانکوباتور75-65درجه سانتیگرادبه مدت 45تا60دقیقه فیکس نمایید. توجه : در لام هاي ثابت شده، امكان زنده ماندن بعضي از باسيل ها وجود دارد. بنابراين درصورت نگهداري لام ها قبل از رنگ آميزي، در داخل محلول فرمالين بمدت 5 دقيقه قراردهید. بعد از خشك شدن نگهداري کنید.

روش رنگامیزی ابتداسطح گسترش رابامحلول فوشین صاف شده بپوشانید. لامها را به آرامی حرارت دهیدتا هنگامی که بخارمتصاعدشود. (حرارت باید 5-3دقیقه به طول انجامد.) ازجوشاندن فوشین یاخشک شدن سطح لام خودداری گردد. پس از شستن لامها سطح گسترش را با محلول رنگبربرای حداکثر3دقیقه بپوشانید. لامهارابه آرامی بشوییدومراقب باشیدکه جریان آب درحدی باشدکه گسترده کنده نشود. تمام گسترش رابا رنگ زمینه (متیلن بلو)به مدت 60ثانیه بپوشانید. سطح لام رابه آرامی باآب شسته ودرحرارت اتاق خشک کنید.

(Ziehl – Neelsen Method) متد ذيل _ نلسون بررسي گسترش ها در نهايت آرامش و با دقت . مناسب ترين ميدان : وجود لوكوسيت، موكوس و سلول هاي مژك دار باسيل ها ممكن است: بصورت منفرد، دوتايي يا دسته جمعي براي گزارش نتيجه منفي، بررسي حداقل 100 ميدان ميكروسكوپي . گزارش لامهای مثبت طبق استاندارد تعریف شده تعداد باسيل هاي دفع شده، هميشه يكسان نيست. بنابراين براي بالا بردن امكان مشاهده باسيل و قطعي شدن تشخيص، سعي بر اين است تا حداقل 3 نمونه دريافت شود. ممكن است فقط در يك نمونه از 3 نمونه صبحگاهي بيمار، باسيل هاي اسيد فست وجود داشته باشد.

مشخصات ظرف نمونه گیری ظرف بایدازجنس پلاستیک شفاف ومحکم باشدبطوریکه نمونه قابل رویت باشد. دهانه ظرف بایستی گشاد،درپیچ دارباقطر7-5سانتیمترباشد. حجم ظرف نمونه بایددرحدود50میلی لیترباشد.حجم نمونه بایستی حداقل 2میلی لیترباشد. مشخصات بیماربایدروی بدنه ظرف نوشته شده باشد.

گزارش نتايج آزمايش ميكروسكوپي رنگ آميزي با ذِیل نلسون × 1000 تعداد باسيل مشاهده شده در F نتايج باسيل مشاهده نشد منفي F 100 / 9 – 1 تعداد باسيل ها / 99 – 10 F 100 + F / 10 – 1 + + 10 < / F + + + F: ميدان ميكروسكوپي

اسمیرمثبت باسیل اسید فست

نگهداري لام ها نگهداري لام ها پس از بررسي و گزارش نتيجه حداقل بمدت يك سال توصيه مي شود.

علل نتايج گسترش مثبت كاذب 1- استفاده مجدد از لام موجب رنگ آميزي خراش هاي موجود در آن مي شود. 2- آلوده شدن روغن ايمرسيون با باسيل هاي گسترش مثبت. 3- آلوده شدن عدسي شيئي با باسيل هاي گسترش مثبت. 4- آلودگي متقاطع هنگام رنگ آميزي، متصل بودن لام ها در رنگ آميزي , انتقال باسيل را از گسترش هاي مثبت به منفي 5- وجود مايكوباكتريوم هاي محيطي درآب مقطر استفاده شده در محلول هاي رنگ و آلوده زدايي.

مراجع اسمیرودیدمیکروسکوپی (مرکزآموزشی ،پژوهشی ودرمانی سل وبیماریهای ریوی مسیح دانشوری ) باکتری شناسی واکر سل واصول مبارزه با آن (دکتررضا قانع شیرازی ) مبانی تشخیص آزمایشگاهی سل (اداره کل پیشگیری ومبارزه بابیماریها) میکروبیولوژی کانمن