کنترل کيفی در سيتولوژی سرويکوواژينال کنترل کيفی در سيتولوژی سرويکوواژينال

يكي از مؤثرترين روش هاي بيماريابي در تاريخچه پزشكي به شرط حفظ كيفيت!

تثبيت يک روش استاندارد برای کنترل کيفيت سيتولوژی سرويکوواژينال ؟!! سيتولوژی سرويکوواژينال ؟!!

Implementation of Quality Assurance program Pre-analytical Quality of smear Analytical Interpretation & Quality of Performance Post- Analytical Reporting

Quality of Smear Proper Sampling Sampling Device Proper spreading Preparation of patient Fixation Staining

رعایت نکات ضروری قبل از نمونه گیری بهترین زمان انجام نمونه گیری روز 14 سیکل است از یک هفته قبل بیمار نباید از انواع کرم های واژینال استفاده نموده باشد از 48 ساعت قبل استفاده از انواع روشهای واژینال جلوگيری از بارداری و دوش واژینال توصیه نمی گردد. مقاربت از 24 ساعت قبل از نمونه گیری نباید صورت گیرد.

نمونه برداری صحيح قبل از نمونه برداری نبايد معاينه سرويکس با انگشت انجام شود قبل از نمونه برداری نبايد اسيد استيک به سرويکس ماليده شود ( کاهش رنگ پذيری سلول و کاهش محتوای سلولی ) قبل از نمونه برداری نبايد سرويکس با سالين شسته شود از اسپکولوم استريل با اندازه مناسب استفاده شود اسپکولوم فقط با کمی آب يا سالين روان شود (لوبريکانت ها رنگ پذيری سلولها را مختل می کنند )

مشاهده بررسی سرويکس از نظر هرگونه ضايعه ارزيابی محل T zone (وابسته به PH واژن – وضعيت هورمونال - حاملگی - يائسگی- درمان های قبلی - آناتومی فرد ) پاک کردن خون- موکوس يا ترشحات بيش از حد از سطح سرويکس

انواع وسايل نمونه برداری Plastic spatula Extended tip spatula Cervical brush Cervical broom Cotton swab Unicum ….

انتخاب وسيله نمونه گيری انتخاب وسيله و تکنيک نمونه گيری در هر فرد با در نظر گرفتن شرايط فرد و محل T zone انجام می شود. توصیه :NCCLS استفاده توا م از اسپاچولا و سيتوبراش

نحوه نمونه برداری

انتقال نمونه از وسيله نمونه برداری بر روی اسلايد شيشه ای به ابعاد CM5/2 x 5/7 وضخامت mm 1

محل انتقال نمونه اندوسرويکس و اکتوسرويکس بر روی اسلايد شيشه ای

هدف : اسمير خيلی نازک : اسمير ضخيم : پخش کردن يکنواخت سلولها به صورت يک لايه نازک بر روی اسلايد شيشه ای اسمير خيلی نازک : آرتيفکت ناشی از خشک شدن در معرض هوا تعداد سلولها کم و پراکنده اسمير ضخيم : فيکساتيو به آن نفوذ نمی کند رنگ به آن نفوذ نمی کند

روش های خاص نمونه گيری بررسی هورمونی: نمونه توسط اسـپاچولا از اپی تليوم ثلث فوقانی دیواره های طرفی واژن گرفته می شود.

نمونه ازvaginal pool : نمونه توسط انتهای پهن تر اسپاچولا از فورنیکس خلفی واژن گرفته می شود.

نمونه جهت بيماريابی زنانی که در معرض DES بوده اند: نمونه توسط اسپاچولا از چهار ربع واژن – از ثلث فوقانی دیواره ها – گرفته می شود. هدف شناسايِی آدنوز ويا ca clear cellاست. تهيه چهار اسلايد که روی برچسب آن محل ربع مربوطه نوشته شده باشد.

گرفتن اسمیر سرويکو واژینال توسط خود فرد توصيه نمی شود چون اغلب نمونه فاقد کفايت است.

فیکساسيون مناسب پس از تهیه اسمير فیکساسيون ظرف چند ثانيه در حالیکه نمونه هنوز خيس است انجام می شود. انواع فيکساتيوها: فيکساتيوهای پوشانندهء سطح ((coating surface F. اتانول 95%

فیکساتيوهای پوشاننده Coating Surface Fixative ترکیب الکل و پلی اتيلن گليکول (کربوواکس) توسط اسپری به سطح اسمير پاشيده می شوند. توسط قطره چکان روی اسلايد ريخته می شود.

فاصله اسپری تا اسلايد: حدوداً 30 سانتی متر يا طبق دستور سازنده نزديک بودن اسپری به اسلايد: ايجاد آرتيفکت جاری شدن مايع فيکساتيو در سطح لام شسته شدن سلولها کنده و پرتاب شدن سلولها دور بودن اسپری از اسلايد: خشک شدن اسلايد و فيکساسيون نامناسب پخش نامنظم فيکساتيو در سطح اسلايد

استفاده از فيکساتورهای مو توصيه نمی شود فيکساتيو ها (بجز الکل ) هماتوکسيلين را آلوده و خراب می کنند قبل از رنگ آميزی ، بايد کربوواکس از سطح اسمير برداشته شود ( قراردادن اسميرها درالکل 95 بمدت 10 دقيقه ) هسته ها کدر و نا مشخص، در غير اين صورت سيتو پلاسم آبی کمرنگ، و رنگ پذيری نامنظم می شود

اتانل 95% WET FIXATION در يک محفظه مناسب ريخته میشود،اسمير تهيه شده سريعا به داخل آن غوطه ور می گردد فيکساسيون ظرف 5تا30 دقیقه انجام ميشود

اسلايدهای غير قابل قبول اسلايدهای شکسته غير قابل ترميم اسلايدی که مشخصات يا شماره مربوط به بيمار روی آن ثبت نشده اسلايدی که برگه درخواست همراه آن فاقد مشخصات و يا اطلاعات بالينی کافی باشد يا مشخصات روی آن با مشخصات ثبت شده روی اسلايد همخوانی ندارد اسلايدی که برگه درخواست همراه ندارد

رنگ آميزی صحيح رنگ آميزی پاپا نيکولائو رنگ آميزی پاپا نيکولائو رنگ آميزی مورد قبول برای نمونه های سيتولوژی و بويژه سيتولوژی سرويکوواژينال در تمام دنيا ، يک رنگ برای هسته، حاوی و دو رنگ متقابل برای سيتوپلاسم می باشد

رنگ آميزی پاپانيکولائو رنگ های مورد استفاده : هماتوکسيلين : برای رنگ آميزی هسته OG-6 برای رنگ آميزی سيتوپلاسم .متشکل از رنگ orange-Gبعلاوه فسفوتنگستيک اسید در اتانل 95% کراتين اگر در سلولهای سنگفرشی موجود باشد آنرا برنگ نارنجی در می آورد. : EA برای رنگ آميزی سیتوپلاسم يک رنگ پلی کروم و ترکيبی ازSF سبز مايل به زرد و EOSINE-Y SFموجود در EAسلولهايی که از نظر متابوليک فعالند را به رنگ سبز در می آورد ) شامل سلولهای اينترمديت و پارابازال ،هيستيوسيتها ،لکوسيتها وسلولهای بدخيم ( هنگامی که در اسمير رنگ سبز کم رنگ می شود ،EA بايد عوض شود.

مراحل رنگ آميزی اول بايد فيکساتيو که روی سطح اسمير است پاک شود)قرار دادن اسمير درالکل 95%) مرحله هيدراتاسيون که سلولها برای رنگ پذيری هسته آماده می شوند)قرار دادن اسميرها در ظروف متوالی الکل با غلظت رو به کاهش ( مرحله رنگ آمیزی هسته )قرار دادن اسميرها در هماتوکسيلين و محلول آبی کننده که رنگ هماتوکسيلين را تثبيت می کند ( مرحله دهيدراتاسيون ،آماده کردن اسميرها برای رنگ آميزی سيتوپلاسم )قرار دادن اسميرها در ظروف متوالی الکل با غلظت رو به افزایش ( مرحله رنگ آميزی سيتوپلاسم )قرار دادن اسميرها درOG،آب کشی در الکل ،EA،آب کشی در الکل( مرحله نهايی دهيدراتاسيون ،آماده کردن اسميرها برای مرحله شفاف سازی )قراردادن اسميرها در الکل مطلق ( مرحله شفاف سازی اسمير )قرار دادن اسميرها در ظرف گزيلن ( مونته کردن اسلايدها.

در رنگ آميزی پاپانيکولائو HYDRATIONسلولها را برای جذب هسته DEHYDRATIONسلولها را برای جذب در سيتوپلاسم آماده می کند. رنگ آميزی پاپانيکولائو به دو متد : REGRESSIVEوPROGRESSIVEانجام می شود. تفاوت اين دو روش در مرحله رنگ آميزی هسته با هماتوکسيلين است .

در متد Regressive هسته توسط هماتوکسيلين غيراسيدی (هماتوکسيلين هاريس)بيش از حد رنگ می شود و در مرحله بعد ، رنگ اضافه با Hcl رقيق رنگبری می گردد و سپس نمونه در آب جاری شسته می شود. در متد Progressive اسمير تا زمانی در هماتوکسيلين می ماند که شدت رنگ هسته بحد مطلوب برسد (رنگبری با Hcl و شستشودرآب جاری لازم نيست ) در مرحله بعد، اسمير درون يک ماده آبی کننده (Blueing agent ) مثل هيدروکسيد آمونيوم قرارمی گيرد که رنگ هسته را تثبيت می نمايد.

NCCLS متد PROGRESSIVE را توصيه می کند. چون شدت رنگ هسته آسانتر قابل کنترل است و تکرار پذيری بهتری را سبب می شود ومرحله آب کشی با آب جاری که باعث از دست رفتن سلولها می شود را ندارد . در هر آزمايشگاه تغييرات مختصری ممکن است در تکنيک و زمان های رنگ آميزی داده شود تا رنگ ايده آل بدست بيايد، مهم اينست که در هر آزما يشگاه روش انجام کار با ذکر جزئيات هر مرحله ، مکتوب شده و مجاور محل رنگ آمیزی نصب گردد .

مزايای پاپانيکولائو جزئيات هسته مشخص است. کروماتين به خوبی رنگ می گيرد شفافيت سيتوپلاسم حتی وقتی سلولها روی هم می افتند،بخوبی حفظ می شود انواع سلولها از يکديگر قابل افتراقند تفاوت در رنگ سيتوپلاسم سلولهای مختلف نشانگر ميزان بلوغ و فعاليت متابوليک آنهاست رنگ برای مدت طولانی ثابت می ماند و نتايج تکرارپذير می دهد

نکاتی در مورد رنگ آميزی پاپانيکولائو اکسيد شدن رنگها در معرض نور تبخير رنگها فيلتر کردن رنگها تعويض رنگها استفاده از آب لوله کشی به جای آب مقطر توجه به کلر آب لوله کشی توجه به زمان های رنگ آميزی نحوه DIP کردن نمونه انتقال نمونه از يک ظرف به ظرف بعدی اثر الکل در از بين بردن رنگ سيتوپلاسم)در صورت مجاور شدن طولانی مدت پس از مرحله رنگ آميزی سيتوپلاسم( عدم استفاده از الکل حاوی بنزِن عدم استفاده از هماتوکسيلين حاوی جيوه

شفاف کردن اسمير بعد از اتمام مراحل رنگ آميزی، سلولها بايد دهيدراته شوند و الکل از درونشان خارج شود و سپس با يک عامل شفاف کننده مجاور گردند تا سيتوپلاسم سلول شفاف شود عامل شفاف کننده بايد بی رنگ باشد عامل شفاف کننده بايد ضريب انکسار مشابه لام، لامل و ماده مونته کننده باشد

گزيلن )دی متيل بنزن( رايج ترين عامل شفاف کننده است که استفاده می شود . گزيلن بايد روزی يک بار فيلتر شود. درصورتيکه محلول گزيلن حبابدار شيری يا صورتی شود، بايد تعويض گردد.

نکات ايمنی کار بار گزيلن _بخار گزيلن توکسيک است . کار با گزيلن بايد زير تهويه مناسب انجام شود . _از تماس گزيلن با پوست اجتناب شود . _گزيلن را نبايد در دستشويی خالی کرد )بدليل متصاعد شدن بخار آن که توکسيک و قابل اشتعال است ( _گزيلن قابل اشتعال است . محل کار با گزيلن نبايد نزديک شعله آتش باشد .

مونته کردن لام ويژگی های ماده ای که برای مونته کردن استفاده می شود : _بايد با عامل شفاف کننده )گزيلن ( قابل امتزاج باشد . _بايد ترانس پارنت باشد. _ضريب انکسار آن مساوی ضريب انکسار لام و لامل باشد . _ ضريب انکسار آن طوری باشد که ايجاد آشفتگی در ميدان ديد نکند. _ويسکوزيتی آن کم باشد تا حباب هوا زير لامل گير نکند . PH _آن خنثی باشد . _حاوی ماده آنتی اکسيدان باشد تا به مرور زمان اسمير زرد يا محو نشود .

مونته کردن لام : _ هنگام مونته کردن سطح لام مرطوب باشد تا آرتيفکتهای قهوه ای ناشی از خشک شدن ايجاد نشوند . _حباب های هوا که ايجاد می شوند بايد خارج شوند.

لامل cover ship _لامل بايد شيشه شفاف درجه يک با ضخامت 0.13-0.17mm باشد. _بايد تمام سطح اسمير را بپوشاند) معمولاً (24 X 60 mm _بايد مسطح باشد و ناصافی نداشته باشد. _باید مقاوم باشد . ضريب انکسار آن مساوی ماده مونته کننده و لام باشد .

Analytical Phase

Personnel requirement Education Skills Training

Number of Specimen processed in a lab. Per Year WHO Consensus panel Recommended : at least 20,000 specimens yearly to maintain acceptable skills CAP review : Screening Error Rate is greatest in labs processing less than 5000 specimen / Yr

Consensus : 60 Slides / Day Workload assessment CLIA : 12 slides / hr 100 Slides / Day Australia : 10 slides / hr 70 Slides / Day U.K : Maximum 4 hr 30 Slides / Day Consensus : 60 Slides / Day

Post-Analytical Phase

Should be Standard & Clear Reporting Should be Standard & Clear

از آماده سازی بيمارو جمع آوری نمونه تا مرحله دريافت نتيجه توسط پزشک Quality Assurance مانيتورينگ سيستماتيک روند انجام کار به منظور شناسايی ،کنترل وپيشگيری از بروز خطا از آماده سازی بيمارو جمع آوری نمونه تا مرحله دريافت نتيجه توسط پزشک

Staining Quality Check Random checking of staining quality of smear

Seeding of known abnormal smear in to the daily workload Evaluation of screener competence

Specimen Adequacy Monitor Between 0.5% to 5% of all smears may reported as unsatisfactory

Review Of Positive Slides Hierarchic Review all of reactive changes & epithelial abnormalities & evaluating the discrepancies (CLIA Recommendation ) Not more than 14% of slides reported as abnormal Not less than 0.5% of slides reported as HSIL

Not more than 96% of slides reported as negative Rescreening of negative slides Detection of FN results & Performance Sensitivity Not more than 96% of slides reported as negative Various Method : 1-Random Rescreening of 10% of negative slides 2-Selective Rescreening of high risk cases 3- 100% Rescreening of negative slides 4-Rapid Rescreening (30 sec obj. 10 )

Causes of false negative results : Sampling error : Sampling or Spreading of the cells Screening error : Detection or Interpretation Slide preparation error : Fixation, Staining, mounting

false Neg. proportion FNP = FNP Ideally less than 5-10% FN FN + TP

Estimation of false Neg. Rate Screening Sensitivity FNR= FNR = FNP + FN due to sampling error + FN due to Slide preparation error FNR usually more than 20% Sensitivity of pap test usually 60-80% FN All of Screened Smear

Cytologic - Histologic Correlation Evaluating Specificity of Screening Discrepancies may be due to : Surgical Sampling Regression of lesion At least 65% of High grade Epithelial Abnormalities Should confirm on Histology

Retrospective Review When a new High grade epithelial abnormality detected by cytology or pathology : All negative cytology obtained within last 5 yrs Should be reviewed Not more than 20% of cases should have cells consistent with High grade epithelial abnormality On review of negative previous slides

Monitoring of the performance Number of epithelial abnormality ASC , LSIL , HSIL , Carcinoma ASC / SIL ratio = 2-3

Proper Archiving of the slides & Reports All Slides ( Neg. & Pos. ) : 5 yrs All Reports : 10 yrs Requisition Form : 2 yrs

Turn around time At least 90% of smears should be reported within 5 working days