Ievads proteīnu kristalogrāfijā (proteīnu rentgenstruktūranalīzē) Kristalogrāfija vai rentgenstruktūranalīze - metode vielas molekulu trīsdimensionālās struktūras noteikšanai, izmantojot rentgenstaru difrakciju vielas kristālos

2014. – starptautiskais kristalogrāfijas gads

Kristalogrāfijas vēsture: ideja 1912. gadā Maksim fon Lauē un Pēterim Paulam Ēvaldam vēsturiskā sarunā Angļu dārzā Minhenē radās ideja apstarot kristālus ar rentgenstariem 1913. gadā tika iegūts pirmais difrakcijas attēls no vara sulfāta kristāla, par ko Lauē 1914. gadā saņēma Nobela prēmiju

Kristalogrāfijas vēsture: pirmā struktūra 1913. gadā Viljams Lorenss Bregs no difrakcijas datiem izskaitļoja NaCl struktūru, par to 1915. gadā saņēma Nobela prēmiju kopā ar savu tēvu Viljamu Henriju Bregu

Kristalogrāfijas vēsture: pirmā proteīna struktūra 1958. gadā tika noteikta pirmo proteīnu – mioglobīna un hemoglobīna struktūras, par ko 1962. gadā Nobela prēmiju saņēma Makss Perutzs un Džons Kendrjū

Kāpēc nepieciešams noteikt proteīnu struktūras? Vizuāls attēls – kā proteīns izskatās Priekšstats par to, kā proteīns veic savas funkcijas Nobela prēmijas...

Nobela prēmijas proteīnu kristalogrāfijā M. F. Perutz, Sir J. C. Kendrew (Chemistry, 1962) for structure of globines Sir A. Klug (Chemistry, 1982) for his development of crystallographic electron microscopy and his structural elucidation of biologically important nuclei acid-protein complexes J. Deisenhofer, R. Huber, H. Michel (Chemistry, 1988) for the determination of the three-dimensional structure of a photosynthetic reaction centre P. D. Boyer, J. E. Walker, J. C. Skou (Chemistry, 1997) for their elucidation of the enzymatic mechanism underlying the synthesis of adenosine triphosphate (ATP) and for the first discovery of an ion-transporting enzyme, Na+, K+ -ATPase R. D. Kornberg (Chemistry, 2006) for his studies of the molecular basis of eukaryotic transcription V. Ramakrishnan, T. A. Steitz, Ada E. Yonath (Chemistry, 2009) for studies of the structure and function of the ribosome Robert J. Lefkowitz and Brian K. Kobilka (Chemistry, 2012) for studies of G-protein-coupled receptors"

Pielietojuma piemērs: jaunu zāļu radīšana Ar kristalogrāfijas palīdzību var noteikt proteīnu struktūras Zinot proteīna aktīvā centra struktūru, var prognozēt, kādi savienojumi tur varētu piesaistīties Labs piemērs – Indinavir (Merck), viens no pirmajiem preparātiem, kuru radīšanā tika pielietota proteīnu kristalogrāfija HIV proteāze Aktīvais centrs

Kādas manipulācijas jāveic, lai noteiktu proteīnu struktūru 1. – proteīna gēna klonēšana (parasti baktērijās) 2. – proteīna producēšana 3. – proteīna attīrīšana 4. – proteīna kristalizēšana 5. – datu vākšana no kristāliem 6. – struktūras noteikšana 7. – struktūras validēšana un deponēšana PDB datu bankā 8. – struktūras publicēšana

Kas ir kristāls ? Trīsdimensionāls identisku vienības šūnu režģis, kuras ir izvietotas vienā noteiktā orientācijā Katra vienības šūna var saturēt vienu vai vairākas molekulas

Kristāls Kristāls Vienības šūna Molekula Šajā gadījumā katrā vienības šūnā ir viena molekula un visas vienības šūnas ir taisnstūru paralēlskaldņi

Molekula Vienības šūna Kristāls Divas molekulas vienības šūnā, kuras malu leņķi nav 90o

Kā iegūt kristālu? Vienkārši no neorganiskajām un mazām organiskajām molekulām Grūti no proteīniem Kāpēc? -nav termostabili -var izmantot tikai uz ūdeni bāzētus šķīdumus -lielas un fleksiblas molekulas -parasti pieejami ļoti nelielos daudzumos

Kā iegūt proteīnu kristālu ? Princips: lēni paaugstināt precipitantu koncentrāciju šķīdumā Precipitanti: dažādi sāļi, polietilēnglikoli (PEG), alkoholi pH buferējošās vielas uztur noteiktu pH – piemēram, acetāta vai tris buferšķīdumi Aditīvi: vielas, kas nav precipitanti, bet mijiedarbojas ar proteīnu un palīdz tos sakristalizēt (piemēram metālu joni) Variējamie parametri: -precipitantu un aditīvu sastāvs -precipitantu un aditīvu koncentrācija -proteīna koncentrācija (parasti ap 1%) -pH -temperatūra (parasti RT, dažreiz +4, +15 vai +37) Parasti nav iespējams teorētiski noteikt, kādi precipitanti un kādās koncentrācijās varētu būt nepieciešami, lai veidotos kristāli Parasti nepieciešams testēt vairākus simtus dažādu apstākļu

Fāzes diagramma [proteīns] nogulsnes kristāli? tīrs šķīdums [precipitants]

Sēdošā piliena iztvaikošanas tehnika Precipitants + proteīns (1:1) Precipitants Iztvaikošanas rezultātā lēnām samazinās piliena tilpums un paaugstinās precipitanta un proteīna koncentrācija

Kristalizācijas robots Var viegli pārbaudīt simtiem apstākļu Var operēt ar ļoti maziem tilpumiem –līdz 0.1 ml

Piekārtā piliena iztvaikošanas tehnika Precipitants + proteīns (1:1) Iztvaikošana Precipitants Princips līdzīgs, kā sēdošajam pilienam, tikai piliens ir «piekārts» pie trauciņa vāka

Olu baltuma lizocīma kristalizēšana ar piekārtā piliena tehnoloģiju Lizocīms ir ļoti viegli kristalizējams proteīns Kristālus var iegūt dažu minūšu laikā Mēs izmantosim piekārtā piliena tehnoloģijas atvieglotu variantu – bez precipitanta trauciņa apakšā Lizocīmu sajauksim ar precipitantu un pilienam ļausim lekcijas turpinājumā lēnām iztvaikot Pēc lekcijas beigām aplūkosim kristālus mikroskopā un pārbaudīsim to difrakcijas kvalitāti

Mini lab. darba protokols Uz stikla plāksnītes sajaucam pilienu no 5 ml lizocīma šķiduma (40 mg/ml) un 5ml precipitanta (30% w/v metilpolietilēnglikols 5,000, 1.0 M NaCl, 50 mM Na acetāts pH 4.5, 5% glicerīns) Plāksnīti nosedz ar Petri plates vāciņu Pēc lekcijas beigām pilienus aplūko mikroskopā Vienu no iegūtajiem kristāliem ar cilpas palīdzību izņem no šķīduma un ievieto krioplūsmā rentgenstaru difrakcijas aparātā Darba vadītājs demonstrē difrakcijas attēlu iegūšanu no kristāla

Kāpēc nepieciešami tieši rentgensari? Viļņa garumam ir aptuveni tāds pats izmērs, kā attālums starp atomiem molekulās

Kā iegūt rentgenstarus? Sinhrotrons Rotējošais anods Daļiņu paātrinātājs Lielā ātrumā mainot kustības virzienu, elementārdaļiņas (elektroni vai pozitroni) emitē rentgenstarus Elektronu kūlis no katoda atsitas pret metāla (parasti Cu) anodu un producē rentgenstarus X-rays Copper anode

Rotējošais anods Sinhrotrons Labi: -Relatīvi lēti (1/2 milj. $) -Relatīvi mazi Slikti: -Radiācija ir vāja -Viļņa garums ir fiksēts Labi: -Radiācija ir spēcīga -Viļņa garums ir maināms Slikti: -Ļoti dārgi (miljardi $) -Ļoti lieli

ESRF sinhrotrons Grenoblē, Francijā Visspēcīgākais rentgenstaru avots Eiropā Akadēmiskiem pētījumiem bezmaksas

Elektromagnētiskie viļņi E = A cos wt w = 2pn E = A cos (a+wt) a = 2pZ/l E- elektromagnētiskā lauka stiprums A- amplitūda w- leņķiskais ātrums n- frekvence l – viļņa garums a - fāze

Vilnis kā vektors F=Acosa+iAsina vai F=exp(ia) Imaginārā ass A A- viļņa amplitūda a- viļņa fāze a Reālā ass F=Acosa+iAsina vai F=exp(ia)

Viļņu interference + = + . =

Kas notiek ar elektronu, kad pa to trāpa rentgenstari? Elektrons sāk vibrēt ar tādu pašu frekvenci, ka krītošie rentgenstari Rezultātā, elektrons izstaro sekundāros rentgenstarus visos virzienos Primārais stars Sekundārie stari

Izkliede no molekulas Primārais stars Molekula sastāv no vairākiem atomiem Atomu sastāvā ir elektroni Ja molekulu apstaro ar rentgenstariem, katrs elektrons izstaro (izkliedē) sekundāros rentgenstarus Izstarotie rentgenstari mijiedarbojas viens ar otru un veido interferenci Kopējā rentgenstaru izkliede no molekulas ir atkarīga no elektronu skaita un to savstarpējā novietojuma Citiem vārdiem sakot, izkliede ir atkarīga no molekulas struktūras Ja mēs zinātu izkliedēto staru amplitūdas un fāzes, vai varētu aprēķināt molekulas struktūru? Primārais stars

Furjē transformācija F(k)= f(x)e-2pikx dx Elektronu blīvuma sadalījums molekulā un molekulas veidotais rentgenstaru izkliedes attēls ir savstarpējas Furjē transformācijas Tātad – ja varētu izmērīt vienas molekulas izkliedēto rentgenstaru amplitūdas un fāzes, struktūras aprēķins būtu trivāls Bet ir divas problēmas...

Praksē... Izkliede no vienas molekulas ir pārāk vāja, lai to varētu detektēt Izkliede no daudzām molekulām atšķirīgās orientācijās (piem. šķīdumā) novedīs pie izkliedēto staru savstarpējas dzēšanās Ja molekulas ir orientētas visas vienā virzienā (kā kristālā), rentgenstaru izkliede pastiprināsies noteiktos virzienos

Brega likums Izkliedētie stari ir vienā fāzē, tie summējas Izkliedētie stari ir pretējās fāzēs, tie savstarpēji dzēšas nl = 2d sinq Brega likums nosaka, ka izkliedētie stari summējas, ja to ceļu garumi atšķiras par n veseliem viļņa garumiem

Tipisks difrakcijas attēls no proteīna kristāla Uz viena attēla ir tikai neliela daļa no visiem teorētiski iespējamajiem difrakcijas punktiem Kristālu pagriež pa 0.2-2 grādiem un iegūst nākošo attēlu un tā tālāk Atkarībā no vienības šūnas izmēra un izšķirtspējas ir jāsavāc 100 -1000 attēlu ar 104-106 difrakcijas punktiem

Izšķirtspēja Mazākais attālums, ko var izšķirt elektronu blīvuma kartē Atbilst mazākajam attālumam starp atstarojošām plaknēm, kurām var saskatīt difrakcijas punktus Augstas izšķirtspējas difrakcijas punkti ir tālāk no attēla centra Izšķirtspēja ir atkarīga no tā, cik perfekti ir izkārtotas vienības šūnas 2Å 3Å 5Å 10Å

No kā atkarīga kristāla kvalitāte? Augstas izšķirtspējas kristāls Zemas izšķirtspējas kristāls No kā atkarīga kristāla kvalitāte? -No molekulu kontaktiem kristālā – no to skaita (vairāk=labāk) un rakstura -No molekulu fleksibilitātes (jo fleksiblāka, jo sliktāk)

Vai kristālu ārējam izskatam ir korelācija ar izšķirtspēju? Kamolzāles raibuma vīrusa kristāli, izšķirtspēja 3.7Å Tā paša vīrusa kristāli (audzēti citos apstākļos). Izšķirtspēja 2.6Å Īpašas korelācijas nav Vienīgais veids kā pārbaudīt kristālu kvalitāti ir ievietot tos rentgenstaros

Fāzes problēma Ar detektoru var izmērīt tikai difrakcijas punktu intensitāti Informācija par fāzēm netiek fiksēta – nav tādas ierīces, kā “fāzesmetrs” Tas nozīmē, ka informācija par fāzēm ir jāiegūst netieši Mazām molekulām (<100 atomu) eksistē tiešās metodes. Tas nozīmē, ka fāzes var izskaitļot no amplitūdām bez jebkādas papildus informācijas. Proteīni ir daudzkārt par lielu lai izmantotu tiešās metodes, tāpēc ir izstrādātas citas metodes

Mazās molekulas (<100 atomu) Difrakcija NaCl NaCl NaCl NaCl Struktūras aprēķins tikai no punktu intensitātēm Proteīni (>>100 atomu) Difrakcija Struktūras aprēķins tikai no punktu intensitātēm

Izomorfā aizvietošana Ieviešot proteīnu kristālos smagos atomus, difrakcijas punktu intensitāte izmainās No izmaiņām var noteikt smago atomu atrašanās vietas un no tām - fāzes Jāizmanto vismaz divi dažādi smagie elementi

Pb2+ A-B B A Fāzes aprēķins Smago metālu struktūras aprēķins kā mazajām molekulām Fāzes aprēķins

Izomorfās aizvietošnas problēmas: 1) Vienības šūnas izmēri var izmainīties. Tas izmainīs difrakcijas režģi un metodi vairs nevar izmantot 2) Proteīna struktūra vai tā orientācija vienības šūnā var izmainīties 3) Kristālu var sabojāt, to mērcējot smago elementu šķīdumā 4) Smagie atomi var nepiesaistīties noteiktās vietās -Problēmas daļēji iespējams risināt, proteīna sastāvā ieviešot selenometionīnu (Selēns ir smags elements)

Molekulārā aizvietošana Šobrīd visizplatītākā metode Var pielietot tikai tad, ja ir zināma līdzīga proteīna struktūra (vismaz 25% sekvences identitāte) Zināmās struktūras fāzes tiek kombinētas ar nezināmās struktūras amplitūdām Kombinēšana ir iespējama tikai tad, ja abu struktūru kristālu vienības šūnu parametri ir identiski un molekulas tajā ir identiskās orientācijās

Fāzes nav zināmas! Novērotās amplitūdas Nezināmā struktūra FFT Kaķis Furjē kaķis Zināma struktūra Izskaitļotās amplitūdas un fāzes Bezastes kaķis FFT Furjē bezastes kaķis

Novērotās amplitūdas, izskaitļotās fāzes FFT Aste ir redzama!

Ja struktūras nav pietiekoši līdzīgas... Pīle Furjē pīle Pīles amplitūdas + kaķa fāzes Kaķis !!!???

Kā praksē kombinēt fāzes un amplitūdas Fāzes un amplitūdas ir iespējams kombinēt tikai no kristāliem ar identiskiem vienības šūnu izmēriem Ja kristālu simetrija vai vienības šūnas izmēri atšķiras, iegūst dažādus difrakcijas režģus Praksē zināmās un nezināmās struktūras proteīnu kristāliem reti kad ir vienādi vienības šūnu parametri Tādēļ nepieciešams zināmo struktūru ievietot teorētiskā kristālā, lai sakristu vienības šūnu parametri un molekulu orientācija Kā noteikt molekulu orientāciju nezināmajā struktūrā???

Teorētiskā difrakcijas režģa aprēķins zināmai molekulai virtuālā kristālā Furjē transformācija Furjē transformācija

Rotācijas un translācijas funkcijas Uzdevumu matemātiski iespējams sadalīt divās daļās – rotācijas meklējumā un translācijas meklējumā (funkcijās) Zināmo molekulu daudzās dažādās orientācijās ievieto virtuālajā kristālā, kura vienības šūnu izmērs ir tāds pats kā nezināmās struktūras eksperimentāli iegūtajam kristālam Katrai orientācijai izskaitļo Furjē transformāciju un iegūst teorētiskās intensitātes Pareizajā orientācijā ir visaugstākā eksperimentālo un teorētisko intensitāšu korelācija

A un B orientācijas ir atšķirīgas Zināma struktūra A Nezināma struktūra B A un B orientācijas ir atšķirīgas Furjē transformācija Difrakcijas punktu intensitātes ir ļoti atšķirīgas

A un B orientācijas ir līdzīgas Zināma struktūra A Nezināma struktūra B A un B orientācijas ir līdzīgas Furjē transformācija Difrakcijas punktu intensitātes ir līdzīgas

Modeļa veidošana Proteīnu sekvences savietošana ar novēroto elektronu blīvumu Vienkārša molekulārajā aizvietošanā Sarežģītāka, ja nav līdzīgas zināmas struktūras Viennozīmīga pie pietiekoši augstas izšķirtspējas (labākas par 3.0 Å) Var tikt automatizēta, ja izšķirtspēja ir 2.5Å vai labāka

2.0 Å

Rifainments (Refinement) Automatizēta modeļa uzlabošana, lai labāk izskaidrotu eksperimentālās amplitūdas Arī fāzes tiek uzlabotas, tādejādi uzlabojas elektronu blīvuma kartes kvalitāte

Validēšana Finālā (?) modeļa kvalitātes pārbaude Kā izskatās aminoskābju ģeometrija? (Ramačandrāna plots, u.c.) Vai nekovalenti saistītie atomi ir pietiekoši tālu viens no otra? Vai aminoskābes iederas apkārtējā vidē? (Hidrofobās proteīna iekšienē, polārās uz virsmas) Vai ūdeņraža saišu donori/akceptori ir kompensēti?

Deponēšana Struktūras deponēšana PDB datu bankā ir priekšnosacījums publicēšanai žurnālos Vajadzētu deponēt arī eksperimentālos datus, lai būtu iespējams ģenerēt elektronu blīvuma karti un pārleicināties, ka modelis tai atbilst

Neuzmanības rezultātā...

Zinātnieks no Scripps institūta publicēja divas pilnīgi nepareizas struktūras Struktūras izraisīja milzīgu interesi, jo bija ļoti atšķirīgas no gaidītā 3 raksti Science, viens JMB un viens PNAS Pēc kļūdas noskaidrošanas, visi raksti tika atsaukti Viss finansējums un prezidenta dotās medaļas atņemtas... Veicot vienkāršu validēšanu, no tā visa varētu izvairīties