ביולוגיה מולקולרית והנדסה גנטית על קצה המזלג ריאקצית PCR Polymerase chain reaction
ביולוגיה מולקולרית ביולוגיה מולקולרית חוקרת בעיקר את מעבר האינפורמציה בין DNA RNA, ועד לחלבון. יש חפיפה בנושאים אלו לתחומים אחרים כגון ביוכימיה וגנטיקה. הנדסה גנטית היא התערבות בגנים של אורגניזם בכלים של ביוטכניולוגיה. החדרת גנים של אורגניזם אחד לאחר, השתקת גנים וכד'
התפתחויות בהנדסה הגנטית חיידקים הונדסו ב1973 עכברים ב1974 ב1982 עכברים מייצרים אינסולין באישור הFDA 1994- מהנדסים את המזון – צמחים עמידים לקרה, עמידים לחמרי הדברה ולמזיקים ובעלי חיי מדף ארוכים וכד' 11 - 2009 יבולים טרנסגניים ב25 ארצות שונות: למשל USA, Brazil, Argentina, India, Canada, China, Paraguay and South Africa
שימושים בהנדסה גנטית משתמשים לייצור אינסולין, הורמון גדילה, נוגדנים מונוקלונליים, חיסונים ותרופות וכן אנזימים לתעשית המזון. הייצור של תוצר הגן המושתל נעשה בחיידקים, שמרים (אאוקריוטים), חיות כגון עזים או פרות (הפקה מהחלב) או צמחים. שימוש בחקלאות כדי לגדל צמחים עמידים לחומרי הדברה או לחרקים, פטריות ווירוסים, או להגדיל יבול או להכניס עמידות למלח, קור או יובש או להגדיל חיי מדף, לשנות ערכים תזונתיים ולשפר טעם וכד' איבחון מחלות במי שפיר ,איבחון מחלות הנגרמות מנגיפים, איבחון סרטן, לימוד על פגמים גנטיים בבני אדם ונסיון לתקן פגמים גנטיים. טיפול במחלות ניווניות ואחרות באמצעות "תאי גזע" עצמיים.
מצב החקלאות הטרנסגנית היום בארה"ב 88% מהתירס, 94% מהכותנה ו93% מהסויה שמגדלים הם זנים מהונדסים גנטית! בעולם – למעלה מ80% מהסויה מהונדסים גנטית, 30% מהתירס ו20% מהקנולה. באירופה התקנות הרבה יותר מחמירות מאשר בארה"ב. חיידקים, שמרים ועובשים לייצור גבינות ויוגורטים, מוצרי מזון כבושים, נקניקים ויין ובירה עברו שינויים בהנדסה גנטית. בארה"ב ובקנדה אישרו שימוש בשמרים מהונדסים לייצור יין
(מעבר האינפורמציה מDNA דרך RNA ועד לחלבון בתאים שלנו) מה קורה באופן טבעי? (מעבר האינפורמציה מDNA דרך RNA ועד לחלבון בתאים שלנו)
המידע הגנטי, המכיל את הוראות הייצור לכל תאי הגוף, נמצא בגרעין התא בDNA * מלבד בתאים חסרי גרעין או בתאי המין המכילים רק חצי מהמידע הגנטי
המידע ארוז בצורה של חוטי כרומטין המורכבים מDNA וחלבונים כמו כן יחולו שינויים בחלבונים שייווצרו בתא, בהתאם לצורכי התא או הגוף, גם במהלך חיי כל תא ותא.
אבני הבנין של ה- DNA נוקליאוטידים לדוגמא – TMP- נוקליאוטיד המכיל טימין. 5 3
מה ששונה בין הנוקליאוטידים הוא הבסיס החנקני
יש 4 בסיסים חנקניים בDNA אדנין וגואנין - פורינים טימין וציטוזין - פירימידינים
הDNA בנוי משני סלילים (גדילים) מלופפים בדנא – הסלילים בנויים מסוכר ופוספט המחוברים ביניהם. שלבי הסולם בנויים מהבסיסים החנקניים. A תמיד מקושר לT G תמיד מקושר לC
גדילי ה DNA מחוברים על ידי הבסיסים החנקניים בקשרי מימן. הסוכר והפוספט מחוברים בקשרים קוולנטיים. הגדילים הם אנטי פרללים- קיימת כיווניות הפוכה. בין A ל T יש שני קשרים. בין G לC יש שלושה קשרים.
גדילי הדנא יכולים להפרד זה מזה בחימום גדילי הדנא יכולים להפרד זה מזה בחימום. תהליך זה הינו הפיך והגדילים יתחברו שוב זה לזה בקירור.
תהליכי דהנטורציה ורהנטורציה
טמפרטורת הדהנטורציה (ההפרדה בין הגדילים) תלויה בתכולת צמדי G-C יחסית לצמדי A-T הטמפרטורה בה הדנא מותך ב50% הוא אופייני למינים השונים. ניתן לעקוב אחר התהליך במכשיר המודד בליעה באור אולטרא סגול
הDNA ארוז כשהוא מלופף סביב עצמו ודחוס בגרעין.
הDNA ארוז בגרעין כשהוא מלופף סביב חלבונים היסטוניים העוזרים באריזת הDNA
הכפלת הDNA נקראת רפליקציה או שכפול הגדילים נפרדים זה מזה. מול כל גדיל נבנה גדיל חדש. הנוקליאוטידים המוספים מתאימים – A מול T G מול C השכפול קורה כשהתא עומד לפני חלוקה. האנזים הפעיל נקרא DNA פולימרז.
הנוקליאוטידים מוספים בצורת dNTP’s ומשתחררים שני פוספטים
כל הדנא מוכפל בזמן הרפליקציה. יש הקפדה על תיקוני טעויות בזמן ההכפלה. לאחר ההכפלה מתחלקים התאים וכל תא מקבל בדיוק את אותו המידע הגנטי.
מה הם הכרומוזומים? הכרומוזומים הם בעצם מולקולות הDNA הנדחסות ונראות במיקרוסקופ בזמן חלוקת התא: במיטוזה או במיוזה. בבני אדם יש 46 כרומוזומים. הDNA ארוז ודחוס פי 10,000 בגרעין 2 מטר DNA יכול להיארז בגרעין של תא שקוטרו 10 מיקרומטר.
גנים מכילים מידע ליצירת חלבונים
מהו גן? גן הוא קטע מהדנא המכיל מידע המועבר לתא. המידע המועבר הוא בצורה של RNA שליח – m-RNA. בסופו של דבר ייבנה בתא פוליפפטיד (שרשרת חלבונית) על פי התכנית הכתובה בגן ושהועברה על ידי הרנא שליח. הרבה מאוד מהדנא מכיל מידע לבנית רנא ריבוזומלי –rRNA, הבונה את הריבוזומים, או tRNA- המעביר את ח' האמינו לבנית החלבון על פי התכנית ברנא שליח. רוב הDNA מכיל רצפים שלא ידוע מה תפקידם.
טבלת הקודונים
פרוייקט הגנום האנושי פרוייקט הגנום האנושי הסתיים ב2003 שנתיים לפני המועד המשוער. (נמשך כ12 שנה). חוקרים מכל העולם (18 מדינות כולל ישראל) חקרו את רצף הנוקליאוטידים בDNA של כמה אנשים. אירגון הפרוייקט נעשה על ידי משרדי האנרגיה והבריאות של ארה"ב וקרן בריטית שהצטרפה. נמצאו 20,000-25,000 גנים בתוך רצף של 3 מיליארד זוגות בסיסים המרכיבים את הד.נ.א. התגלו 1400 גנים פגועים לעומת 100 שהיה מידע עליהם קודם לכן.
כמה גנים יש בגנום האנושי? רק פי שניים מזבוב וקצת יותר מתרנגולת...
התפתחו שיטות לריצוף והגברת כמות הד.נ.א. כיום יש מכונות המיועדות לריצוף הד.נ.א. כדי לרצף מקטעי ד.נ.א יש צורך להגביר את הכמות. אחת הריאקציות החשובות שקידמו את נושא המחקר המולקולרי נקראת ריאקצית הPCR Polymerase Chain Reaction
מה מטרת הריאקציה הגברת כמותית של קטע ספציפי של DNA פי יותר ממיליארד. משתמשים במערכת הלקוחה מהחי ומחקים אותה במבחנה – in-vitro.
מתי משתמשים בריאקציה זו? פיענוח פשעים – DNA מזירת הפשע בכמות מזערית משמשת לזיהוי הקרבן או הפושע. זיהוי חיידקים, וירוסים או אפילו DNA ממאובנים או מענבר וכד' בדיקות גנטיות – הגברה כמותית של גן מסויים. בדיקה של רצף DNA כלשהו למטרות ידע, מחקר. שימוש בהנדסה גנטית – "השתלה" של DNA ממין אחד למין אחר כדי שיתבטא שם.
צעדים חוזרים על עצמם בין 30-40 פעמים מהי הריאקציה? דהנטורציה – הפרדת גדילי הDNA זה מזה חיבור התחלים – רצפי DNA ספציפיים המתאימים לקטע המסויים אותו רוצים להגביר. הארכת הDNA על ידי Taq Polymerase
צעדי הPCR
מה צריך לביצוע הריאקציה? תחלים - רצפי נוקליאוטידים קצרים (b8-20) המתאימים למקום ספציפי בDNA שאותו רוצים להגביר. אנזים Taq Polymerase המיוחד בכך שהוא עמיד בטמפרטורות הגבוהות והטמפרטורה האופטימלית לפעילותו היא 72°C. בופר המתאים לאנזים. נוקליאוטידים – בצורה של dNTP’s. מקור לDNA בכמות מזערית.
הריאקציה מתבצעת בכמויות מזעריות
מכשיר הPCR במכשיר מוכנסות המבחנות עם החומרים הנחוצים לריאקציה. המכשיר מעלה ומוריד טמפרטורה במהירות לפי תכנית.
הרצה של תוצרי PCR על ג'ל אלקטרופוריזה (שדה חשמלי) גילוי מוטציה לβתלסמיה