كنترل كيفي ديسكهاي آنتي بيوتيك بسم الله الرحمن الرحيم كنترل كيفي ديسكهاي آنتي بيوتيك

- شيوه هاي كنترل كيفيت و تضمين كيفيت هدف در آزمايش تعيين حساسيت ميكروبي ، كنترل كيفيت شامل روال هايي براي پايش كارايي تمام مراحل و اجزاي آزمايش ، جهت اطمينان از نتايج قابل اعتماد است . اين منظور با آزمايش سويه هاي كنترلي در مقابل عوامل ضد ميكروبي با حساسيت شناخته شده به دست مي آيد ، اما به آن محدود نمي شود . اهداف برنامه كنترل كيفيت ، پايش موارد ذيل است دقت ( تكرار پذيري ) و صحت روش سنجش حساسيت كارايي موادي كه در آزمايش استفاده مي شوند كارايي افرادي كه آزمايش را انجام داده و نتايج را مي خوانند

مسئولیت و پاسخگویی را می توان بطور منطقی بشرح ذیل تقسیم نمود: تولید کنندگان (برای محصولات داخلی یا تجاری) پایداری عوامل ضدمیکروبی برچسب گذاری مواد ضدمیکروبی توان محلول های مادر (stock)عوامل ضدمیکروبی تطابق با اصول عملکرد مطلوب ساخت ( برای مثال استانداردهای سیستم کیفیت) سالم و بی عیب بودن محصول قابلیت ردیابی و پاسخگویی به گیرندگان محصول

آزمایشگاه ها (کاربران) : ذخیره سازی در شرایط محیطی توصیه شده توسط تولید کننده ( برای جلوگیری از تخریب دارو) مهارت کارکنان انجام دهنده آزمایش استفاده از استانداردهای جاری CLSI ( یا دستورالعمل های تولید کننده برای استفاده) تبعیت از روشهای مصوب (بعنوان مثال تهیه مایه میکروبی، شرایط گرمخانه گذاری، تفسیر نتایجMIC)

:انتخاب سویه های کنترل کیفی برای انجام کنترل و تضمین کیفیت هر سویه کنترلی باید از یک منبع شناخته شده (مثلاً ) تهيه شودATCC ،مناسب برايCLSIتمام سویه های کنترلی توصیه عوامل ضدمیکروبی و روش مرجع باید ارزیابی شود و نتایج مورد انتظار ثبت گردد

CLSIسويه هاي کنترل کيفي پيشنهادي توسط Enterococcus faecalis ATCC® 29212   Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli ATCC 35218 Haemophilus influenzae ATCC 49247 Haemophilus influenzae ATCC 49766 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Enterococcus faecalis ATCC 29212همچنين براي کنترل ديسکهاي آمينو گليکوزيد با دوز بالا به کار مي رود. E.coli ATCC 35218فقط به عنوان يک ميکروارگانيسم کنترلي براي ترکيبات ممانعت کننده بتالاکتاماز، مثل ترکيبات حاوي کلاولانيک اسيد، سولباکتام يا تازوباکتام پيشنهاد مي شود Klebsiella pneumoniae ATCC 700603به عنوان يک سويه کنترلی براي آزمايشاتESBL به کار برده میشود.

کنترل کيفيت قطر هاله عدم رشد سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکي سويه هاي کنترل کيفي را بايد به روش استاندارد دیسک دیفیوژن و با استفاده از همان مواد و روشي که براي سويه هاي جدا شده از نمونه هاي کلينيکي استفاده مي شود آزمايش و نتايج را با جداول CLSIمقایسه و بررسی نمود.محدوده قطر هاله عدم رشد قابل قبول براي هر سويه کنترلي نسبت به يک ديسک آنتي بيوتيکي در جداول فوق فهرست شده است.

کنترل کيفيت قطر هاله عدم رشد سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکي

آزمايش کنترل کيفيت را بايد درچه فواصل زماني انجام داد ؟ الف _ انجام آزمايش روزانه براي هر سويه کنترلي با يک ديسک آنتي بيوتيکي بايد ۲۰ یا30 روز متوالي آزمايش تعيين حساسيت انجام و نتايج با مقادير قابل قبول جداول تفسيرقطر هاله براي سويه هاي استاندارد مقايسه گردد . بر اساس ضريب اطمينان ۹۵ % تنها يک مورد از ۲۰ نتيجه قرائت شده یا3مورد از30نتیجه مي تواند خارج از محدوده كنترل باشد. چنانچه بيشتر از يک مورد از 20 نتیجه یا بیش از 3مورد از 30نتیجه خارج از محدوده کنترل باشد نياز به اقدامات اصلاحي خواهد بود.

ب _ انجام آزمايش هفتگي - در صورتيكه تنها يک مورد از ۲۰ نتيجه قطر هاله عدم رشد براي هر سويه کنترلي / ديسک آنتي بيوتيكي خارج از محدوده قابل قبول قرار گيرد،كنترل كيفي روزانه را به هفتگي تغيير دهيد. - آزمايش کنترل کيفي هفتگي را يکبار در هفته و هم چنين زمانيکه يکي از عوامل آزمايش (مانند سري ساخت آگار يا ديسکهای تهيه شده از يک سازنده) تغيير کند، انجام دهيد . اگر هر يک از نتايج کنترل کيفي هفتگي خارج از محدوده قابل قبول باشد ، انجام اقدامات اصلاحي مورد نياز است.

اقدامات اصلاحي الف _ نتايج خارج از محدوده قابل قبول به دليل خطاهاي مشهود و واضح شامل: - استفاده از ديسک اشتباه - استفاده از سويه کنترلی اشتباه - آلودگي واضح سويه - استفاده غيرعمدی از دما و شرايط اشتباه انکوباسيون بوجود آمده است . دراين حال بايد دليل ايجاد خطا مکتوب و پس از اصلاح آزمايش دوباره تکرار شود . اگر نتايج گزارش شده در محدوده مورد نظر قرار گرفت ، عمليات اصلاحي بيشتري مورد نياز نمي باشد

ب _ عامل ايجاد نتايج خارج از محدوده کنترل نامشخص است ب _ عامل ايجاد نتايج خارج از محدوده کنترل نامشخص است. در اين حال بايد اقدامات اصلاحي فوري - آزمايش را جهت يک سويه کنترلي / ديسک آنتي بيوتيکي براي ۵ روز متوالي تکرار و همه نتايج را ثبت كنيد. در محدوده قابل قبول باشد - اگر اندازه هر ۵ قطرهاله اقدام اصلاحي بيشتري مورد نياز نمي باشد . - اگر اندازه هر يک از ۵ قطر هاله عدم رشد خارج از محدوده قابل قبول باشد ، به عمليات اصلاحي اضافي نياز است. - آزمايشهاي کنترلي روزانه بايد ادامه داده شود تا به دليل نهايي مشکل پي برده شود

اقدام اصلاحی اضافی (Additional corrective Action) اگر اقدام اصلاحی فوری مشکل را حل نکند در این حالت احتمال وجود خطای سیستماتیک نسبت به خطای اتفاقی بیشتر است لازم است بررسی بیشتر و اقدام اصلاحی انجام شود در صورت لزوم سویه کنترل کیفیت جدید ( از ذخیره فریز شده یا از سایر منابع قابل اطمینان) همراه با سری جدیدی از مواد (شامل استاندارد نیم مک فارلند)را در صورت امکان از تولید کننده ها متفاوت تهیه نمایید. اگر مشکل از تولید کننده بود با تولید کننده تماس بگیرید و مشکل را مطرح کنید ..

پاره ای از علل نتایج خارج از کنترل شامل موارد ذیل است اما به این موارد محدود نمی شود:   سویه کنترلی : استفاده از سویه کنترلی اشتباه انبارش نامناسب نگهداری نامناسب ( برای مثال استفاده از یک کشت کاری به مدت طولانی تر از یک ماه) آلودگی زنده نبودن باکتری ها تغییر در ارگانیسم ( برای مثال جهش از دست رفتن پلاسمید)  

چنانچه تغيير در ميانگين قطر هاله عدم رشد ناشي از خطا در روش انجام آزمايش نباشد ، احتمالا " ناشي از تغيير در حساسيت ذاتي باکتري نسبت به آن آنتي بيوتيک مي باشد. در اين صورت لازم است کشت تازه از سوش کنترل تهيه شود .

مراحل آزمایش: استفاده از شرایط یا دمای گرمخانه گذاری نادرست مایه میکروبی بطور غیرصحیح تهیه یا تنظیم شده باشد. تهیه مایه میکروبی از کلنی هایی که مدت گرمخانه گذاری آنها مناسب نبوده است. مایه میکروبی از کلنی هایی تهیه شده باشد که روی محیط های افتراقی یا انتخابی حاوی عوامل ضدعفونی یا سایر ترکیبات مهارکننده رشد کرده اند. استفاده از دیسک اشتباه قراردهی ناصحیح دیسک( برای مثال تماس ناکافی با سطح آگار) قرائت یا تفسیر نتایج آزمایش بطور نادرست خطا در ثبت و انتقال اطلاعات

ملزومات آزمایش: -شرایط حمل یا انبارش نامناسب -آلودگی -استفاده از ظروف پتری معیوب (برای مثال محیط خیلی ضخیم یا خیلی نازک) -استفاده از ظروف پتری آسیب دیده (برای مثال ترک خورده) -استفاده از مواد تاریخ مصرف گذشته  

اگر مشکل شناسایی و اصلاح شد برای بازگشت به آزمایش کنترل کیفیت هفتگی لازم است برای 5 روز متوالی دیگر عملکرد مطلوب آزمایش ثبت شود اگر مشکل شناسایی نشود و نتایج بدون هر گونه اقدام اصلاحی خاص مجدداً در محدوده کنترل قرار گیرد برای بازگشت به آزمایش کنترل کیفیت هفتگی لازم است برای 20 یا 30 روز متوالی دیگر عملکرد مطلوب آزمایش ثبت شود.

ذخيره سازي ديسك هاي ضد ميكروبي جهت نگهداري ديسك ها توجه به شرايط ذيل ضروري است . ديسك ها را تا زمان تاريخ انقضاء بايد در يخچال ( دماي 8 درجه سانتي گراد يا كمتر ) يا در فريزر ( 14 – درجه سانتي گراد يا كمتر ) نگهداري كنيد ديسك ها نبايد در فريزرهايي با قابليت ذوب يخ خود به خودي ، نگهداري گردند . بسته هاي باز نشده ديسك هاي كلاس بتالاكتام بايد در فريزر نگهداري شوند و به مقدار كم و مصرف حداكثر يك هفته ، از فريزر خارج شوند و در يخچال نگهداري گردند . بعضي آنتي بيوتيكهاي حساس ( مانند ايمي پنم ، سفالكر ( cefaclor ) و تركيبات حاوي كلاولانيك اسيد ) در صورت نگهداري در فريزر تا زمان مصرف ، از پايداري بيشتري برخوردار خواهند بود .

بسته هاي باز نشده حاوي ديسك را 2 -1 ساعت قبل از مصرف ، از يخچال يا فريزر خارج كنيد تا به دماي اتاق برسد . اين كار تماس هواي گرم با ديسك يخ زده و متعاقباً تغليظ دارو در سطح ديسك را به حداقل مي رساند ديسك ها توسط توليد كنندگان در بسته هاي غير قابل نفود به رطوبت ارائه مي گردند . لازم است از بازكردن بسته حاوي ديسك ، به ميزان بيش از مقدار مورد نياز خودداري گردد . در صورت باز كردن بايد ديسك ها را در لوله هاي در پيج دار محتوي ماده جاذب رطوبت به مقدار كافي استفاده نمود بايد اجازه داده دستگاه توزيع كننده ديسك قبل از باز شدن به دماي اتاق برسد در صورت تغيير رنگ معرف ، ماده جاذب رطوبت را تعويض نمائيد و به اين وسيله از رطوبت اضافي جلوگيري كنيد .

وقتي از دستگاه توزيع كننده حاوي ديسك استفاده نمي شود بايد آن را در يخچال قرارداد . فقط از ديسك هايي استفاده كنيد كه هنوز به تاريخ انقضاء قيد شده روي بر چسب نرسيده اند ديسك ها را با اتمام تاريخ انقضاء دور بريزيد .

. مواد مورد نياز براي آزمايش تعيين حساسيت ميكروبي 1 مولر هينتون آگار به دلايل ذيل MHAرا به عنوان بهترين محيط جهت باكتري هاي كم نياز در نظر گرفته است . در سري ساخت هاي متفاوت ، تكرار پذيري قابل قبولي را نشان مي دهد . مهار كننده هاي آن به حدي اندك است كه نمي تواند نتايج آزمايش حساسيت سولفوناميد ، تري منوپريم و تتراسايكلين ها را تحت تاثير قرار دهد . رشد اكثر عوامل بيماري زاي كم نياز را به طور مطلوب تامين مي كند

PH آگار پس از ژله شدن در دماي اتاق ، بايد در حد7/4-7/2باشد PH محيط مولر هينتون آگار را براي هر نوبت ساخت بايد كنترل نمود ، PH محيط آگار پس از ژله شدن در دماي اتاق ، بايد در حد7/4-7/2باشد PH را از طريق يكي از موارد زير كنترل نمائيد . روش اول روش خيساندن تمام مولر هينتون آگار يك پتري را ظرف كوچك كاملاً له كنيد آب مقطر ( 3 -2 ) ميلي ليتر اضافه گردد و به مدت ده دقيقه بخسيانيد سپس نوك الكترود ph متر را در اين مخلوط غوطه ور كنيد . روش دوم : نوك الكترود ph متر را در داخل ارلن كوچكي قرار دهيد مقدار اندكي از آگار مذاب را به داخل ارلن ريخته پس از سفت شدن آگار ph را اندازه گيري نمائيد . روش سوم : از الكترودهاي سطحي استفاده نمائيد .

2 رطوبت در صورت خيس بودن سطح آگار در زمان مصرف ، ظرف پتري را با روپوش نيمه باز به مدت 30 -10 دقيقه درگرمخانه 35درجه و يا زير هود كلاس دو دردماي اتاق قرار دهيد تا رطوبت اضافي آن تبخير گردد تلقيح باكتري ، سطح محيط كشت بايد مرطوب ولي فاقد قطرات آب روي آگار يا درپوش ظرف پتري باشد .

3 اثرات تايميدين يا تايمين وجود مقادير زياد تايمين و تايميدين در محيط مولر هينتون آگار مي تواند اثرات مهار كنندگي سولفوناميدها و تري متوپريم را معكوس نمايد ، منجر به كاهش ، عدم وضوح يا از بين رفتن هاله عدم رشد و گزارش مقاومت به صورت كاذب گردد . براي ارزيابي كيفيت هر بسته از محيط مولر هينتون آگار بايد از انتروكوكوس فكاليس ATCC33186 , Atcc29212 و ديسك هاي تري متوپريم – سولفامتوكسازول استفاده نمود هاله عدم رشد 20mm با حاشيه واضح ، نشانگر كيفيت مناسب محيط است قطر هاله عدم رشد 20mm عدم وجود هاله و يا رشد كلني ها در داخل هاله عدم رشد ، بر كيفيت نامناسب محيط مورد نظر دلالت دارد .  

تهيه محيط هاي كشت و محلول ها محيط هاي جامد مولر ، هينتون آگار تهيه محيط مولر هينتون آگار شامل مراحل زير است محيط مولر هينتون آگار از محيط پايه تجاري و بر اساس دستورالعمل توليد كننده تهيه نمائيد . بلافاصله بعداز اتو كلاو محيط را در بن ماري 50 – 45 درجه سانتيگراد خنك نمائيد . محيط تازه تهيه شده خنك رادر ظروف پتري ، با كف صاف و جنس شيشه اي يا پلاستيكي بر يك سطح صاف ( تراز ) قرار دهيد تا عمق يك نواخت به ميزان 4 ميليمتر ايجاد گردد . اين ميزان معادل 70 – 60 ميلي ليتر محيط براي ظروف پتري با قطر 150 ميلي متر و 30 – 25 ميلي ليتر براي ظروف پتري با قطر100 ميلي متر مي باشد

ظروف پتري حاوي محيط جامد در دماي اتاق خنك تر شود و جز مواردي كه در همان روز مصرف خواهند شد بقيه را در يخچال ( 8 – 2 ) سانتيگراد نگهداري كنيد . ظروف پتري را طي 7 روز بعداز تهيه استفاده كنيد در غير اينصورت براي آن كه خشك شدن آگار به حداقل برسد ، اقدامات پيشگيرانه كافي ، تاثير قراردادن ظروف پتري در كيسه هاي پلاستيكي را انجام دهيد . براي ارزيابي عدم آلودگي لازم است يك نمونه از هر سري ساخت ظروف پتري در دماي 2 ± 35 درجه سانتيگراد به مدت 24 ساعت يا بيشتر گرم خانه گذاري شود .

PH محيط تهيه شده از هر سري ساخت جديد را ارزيابي كنيد روش مناسب مورد استفاده عمدتاً به نوع PH متر موجود در آزمايشگاه بستگي دارد . PH محيط آگار بايد در دماي اتاق بين 7/4 – 7/2 باشد . بنابر اين بايد بعداز بسته شدن آگار اندازه گيري شود اگر PH محيط كمتر از 7/2 باشد برخي داروها توان خود را از دست خواهند داد ( مانند آمينو گليكوزيد ها و ماكروليدها ) در حالي كه برخي ديگر فعاليت زيادتري نشان خواهند داد . ( مانند تتراسايكلين ها ) اگر PH بيشتر از 7/4 باشد ممكن است تاثيرات معكوس ظاهر شود.

GC agar+1% defined supplement ارگانيسم محيط نحوه تلقيح شرايط انكوباسيون زمان انكوباسيون سويه كنترل كيفي تعداد ديسك مجاز H.Influenezae H.paraInfluenezae HTM سوسپانسيون مستقيم MHBيا سالين تهيه شده از ظرف پتري شكلات آگار يك شب مانده ترجيحا 20-24 2±35 %5CO2 16-18h H.Influeneza ATCC49247 H.Influeneza ATCC49766 ATCC 49766 حداکثر 9 دیسک را روی ظرف پتری 150 میلیمتری و 4دیسک را روی ظرف پتری100 میلیمتری آزمایش کنید N.Gonorrhoeae GC agar+1% defined supplement سوسپانسون مستقيم از كلني در MHBيا سالين فسفات بافر 0.9%وpH=7تهيه شده از ظرف شكلات آگار در %5CO2 1±36 20-24h N.gonorrhoeae ATCC49226 حداکثر 9 دیسک را روی ظرف پتری 150 میلیمتری و 4دیسک را روی ظرف پتری100 میلیمتری آزمایش کنید.برای بعضی عوامل مانند فلوروکینولون ها یا سفالوسپورین ها فقط 2تا3دیسک را میتوان در هر ظرف پتری آزمایش کرد S.pneumoniae MHA+ Blood sheep%5 سوسپانسيون مستقيم MHBيا سالين تهيه شده از ظرف پتري بلادآگار خوندار يك شب مانده ترجيحا 20-18 S.Pneumoniae ATCC49619 حداکثر 9 دیسک را روی ظرف پتری 150 میلیمتری و 4دیسک را روی ظرف پتری100 میلیمتری آزمایش کنید.هاله مهار رشد را اندازه گیری نمایید نه هاله همولیز را شرایط انجام آزمایش تعیین حساسیت ضد میکروبی به روش انتشار از دیسک برای ارگانیسم های پرنیاز

سوسپانسيون مستقيم MHBيا سالين Streptococcus spp MHA+ Blood sheep%5 سوسپانسيون مستقيم MHBيا سالين 2±35 %5CO2 20-24h S.Pneumoniae ATCC49619 حداکثر 9 دیسک را روی ظرف پتری 150 میلیمتری و 4دیسک را روی ظرف پتری100 میلیمتری آزمایش کنید. N.meningitidis سوسپانسيون مستقيم از كلني در MHB يا سالين تهيه شده از ظرف پتري شكلات آگار 20-24 ساعته گرمختنه گذاري شده در %5CO2 %5CO2( E.Coli ATCC25922 For ciprofloxacin, nalidixic acid &minocycline حداکثر 9 دیسک را روی ظرف پتری 150 میلیمتری و 2دیسک را روی ظرف پتری100 میلیمتری آزمایش کنید.

جدول انتخاب آنتی بیوتیک انتروباکتریاسه ادراری سودوموناس بستری سرپائی ادراری غیرادراری آمیکاسین جنتامایسین سیپروفلوکساسین سفازولین سفالوتین سفتازیدیم سفوتاکسیم افلوکساسین امیکاسین سفپیم تازوسیم نیتروفورانتوئین آزترونام SXT ایمیپنم یا مروپنم

استرپتوکوک انتروکوک استافیلوکوک اریترومایسین - غیر ادراری ادراری افلوساکسین سرپائی بستری SXT سیپروفلوکساسین وکلیندا SXT (عفونتهای زخم) نیتروفورانتوئین آزیترومایسین Linezoeid امپی سیلین RIFA , SXT (سل) کلیندامایسین سفوتاکسیم جنتامایسین سفپیم تتراسایکلین ونکومایسین سفوکسیتین(تشخیصی)

با تشكر و خسته نباشيد