ОПТИЧНО И ЕЛЕКТРОХИМИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ КИНЕТИКАТА НА АДСОРБЦИЯТА НА ФЕРИТИН И АЛБУМИН ВЪРХУ ТВЪРДА ПОДЛОЖКА 2007

Актуалност: При процесите на адсорбция и десорбция, и при интегрирането им в мембраната белтъците претърпяват определени структурни изменения, които силно променят техните физико-химични свойства. Кинетиката на адсорбцията на белтъци е свързана, както със състоянието на повърхността на мембраната (подложката), а така и със свойствата на заобикалящата среда. Феритинът е един от белтъците в организма, които го предпазват от токсичния ефект на свободното желязо. Албуминът и феритинът участват при елиминиране действието на свободните на свободните радикали при патологии като диабет, рак, ревматоиден артрит, а също и при бъбречни, сърдечно-съдови, възпалителни, инфекциозни и неврологични заболявания. Усъвършенстването на електрохимични биоимпедансен сензор за по-ранно откриване на патoлогии е мотивация за редица работи. В нанотехнологиите взаимодействието между белтъците и повърхностите е крайъгълен камък за асемблирането на протеинови интерфейси като сензори, активатори и други функционални компоненти на биологично-електронно ниво. Разбирането на протеин-повърхнинните взаимодействия до създаването на нови наноматериали и технологии.

Цел на изследването: Изследване кинетиката на адсорбция на феритин и албумин върху златна повърхност

Експериментални задачи: Изследване поведението на зарядите на граничната повърхност белтък/твърда подложка Изследване динамиката на натрупване на белтъците върху твърда подложка Характеристика на взаимодействията белтък/твърда повърхност в електрохимичната система Определяне на концентрациията на адсорбираните белтъци Изграждане на еквивалентна електрическа схема на електрохимичната клетка Елипсометрично изследване кинетиката на адсорбция на феритин и албумин и представяне на моделна система

Феритин Структура: Феритинът има формата на сфера. В сферата желязото се складира в Fe(III) окислено състояние, включен в минерална ферихидритна сърцевина, която е прикрепена за вътрешните стени на сферата. 450 kDa Функции: Феритинът е ключ към контрола на количеството желязо в нашето тяло. Той складира желязото и го освобождава в контролиран процес. Феритинът е “буфер” срещу желязна недостатъчност и при желязно претоварване в организма.

Феритинът - желязо редуцираща система 1. Първата стъпка е редукция на Fe(III) в желязното ядро до Fe(II), използвайки ДХФ като редуциращ агент. 2. След редукцията Fe(II) напуска белтъка през канал. Извън белтъка Fe(H2O)62+ реагира с три-дианионни ферозинни лиганди, образувайки [Fe(ferrozine)3]4-

Човешки серумен албумин Структура: M = 45kDa Функции: Участва в регулацията на потока на кръвта и транспорта на мастните киселини

Електрохимични методи Методи на изследване кинетиката на адсорбция на феритин и албумин върху златна подложка Елипсометрия Електрохимични методи Циклична волтамперометрия Импедансна спектроскопия

ЕЛИПСОМЕТРИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ АДСОРБЦИЯТА НА ФЕРИТИН И АЛБУМИН ВЪРХУ ЗЛАТНА ПОДЛОЖКА

ЕЛИПСОМЕТРИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ АДСОРБЦИЯТА НА ФЕРИТИН И АЛБУМИН ВЪРХУ ЗЛАТНА ПОДЛОЖКА Г (ng/mm2)= К х thickness (nm) K  1.36 g ml-1

Изследване кинетика на адсорбция на феритин и албумин върху златна повърхност Зависимост на адсорбираното количество Г от времето: А) 1mg/1ml ЧСА (KH2PO4, NaHPO4) pH7 B) 1mg/1ml ЧСА (NaHCO3) pH10 Зависимост на адсорбираното количество Г от времето: А) 10-1M Феритин (KH2PO4, NaHPO4) pH7 B) 10-2M Феририн (KH2PO4, NaHPO4) pH7

Изследване кинетика на адсорбция на феритин и албумин върху златна повърхност Кинетиката на изследваните белтъци показва, че адсорбцията на албумин протича с по-голяма скорост върху златната подложка в сравнение с адсорбцията на феритин, което се обуславя от структурата на белтъка, т.е. афинитета на -SH групите към Au повърхност.

ЕЛИПСОМЕТРИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ АДСОРБЦИЯТА НА ФЕРИТИН И АЛБУМИН ВЪРХУ ЗЛАТНА ПОДЛОЖКА

Допълнителни изследвания на: 1. Естествената оптична активност на разтвора може да предизвика изменение на поляризационното състояние на снопа С Поляриметър Palomat A на дължина на вълната 546.1 nm (Hg-лампа) и кювети с дължина 100 mm (HSA) и 50 mm (Fer) 2.Показателят на пречупване на разтвора, който зависи от концентрацията на разтворените вещества рефрактометрични измервания на разтворите при различни температури

ЕЛЕКТРОХИМИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ Четириелектродна електрохимична клетка: Четириелектродна електрохимична клетка:

Изследване зависимостта на импеданса от температурата T = 32.52C T = 31.4C T = 30.8C T = 30.3C T = 29.9C T = 29.6C Получените резултати за промяната на импеданса в зависимост от температурата, показват че процесът на адсорбция на феритина е бавен процес, то адсорбцията на албумина протича бързо в първите 10 минути с бавна дифузия, т.е. осъществява с последваща реорганизация на белтъка върху повърхността.

ЦИКЛИЧНА ВОЛТАМПЕРОМЕТРИЯ 5 мг/1мл Човешки Серумен Албумин в (KH2PO4 ,NaHPO4), pH7

ИМПЕДАНСНА СПЕКТРОСКОПИЯ Ep = 0,317V 5 мг/1мл Човешки Серумен Албумин в (KH2PO4 ,NaHPO4), pH7

ЦИКЛИЧНА ВОЛТАМПЕРОМЕТРИЯ 10-1 M Феритин в (KH2PO4, NaHPO4), pH7

ИМПЕДАНСНА СПЕКТРОСКОПИЯ 10-1 M Феритин в (KH2PO4, NaHPO4), pH7

На основа на закономерностите, описващи импеданса на електрическите вериги бе съставена програма симулираща действието на импедансометър, към който е включена паралелна RC електрическа верига. Резултатите се извеждат графично като Варбург диаграма. Изчисляват се също капацитета и омовото съпротивление на адсорбирания слой.

За капацитета на адсорбирания слой при феритин получаваме: C = 4.9 10-8F при честота на сканиране от 3300 Hz до 0 Hz и C = 4.9 10-9F при честота на сканиране от 3250 Hz до 0 Hz. При разглежданията за албумин са получени високи стойности за капацитета на двойния слой (C=9.9 10-4F). Те са потвърждение за това, че при процеса на адсорбция на албумин върху твърда повърхност (Au), белтъкът действа като блокиращ агент.

ИЗВОДИ: Чрез цикличната волтамерометрия и импедансната спектроскопия се характеризират взаимодействията в електрохимичната система. Данните от импедансната спектроскопия на феритин показват бърза адсорбция и бавна дифузия, т.е. поради големите размери на молекулите. Скоростта, с която се формира слоя зависи, както от приложения потенциал, така и от pH на белтъчните разтвори. Експериментално получените повърхнинни концентрации за феритин и албумин показват линейно нарастване на количеството адсорбиран на повърхността белтък с нарастване на температурата. Въз основа на закономерностите, описващи импеданса на електрическите вериги бе съставена програма симулираща действието на импедансометър, към който е включена паралелна RC електрическа верига. Резултатите се извеждат графично на диаграма. Изчисляват се също капацитета и омовото съпротивление на адсорбирания слой. Елипсометрично са проследени динамичните промени на адсорбирания белтък на повърхността. Поради афинитета на -SH групите на албумина към златната повърхност, количеството на адсорбираният белтък е два пъти по-голямо от адсорбираното количество на феритина.

Приноси: 1. Разработване на клетка и експериментална методика за определяне на количеството адсорбиран белтък чрез елипсометрични измервания 2.Изработен е математически модел за описващ кинетиката на адсорбция на белтъци чрез елипсометрично измерване 3. Разработена е нова четириелектродна електрохимична клетка 4. Изследвано е поведението на зарядите на граничната повърхност белтък/Au 5. Създаден е модел, на протичащите процеси и взаимодействията в електрохимичната система

Участия в конференции – доклади и постерни съобщения: 1. Meeting in Physics, 2005: Studies of Kinetics of Protein Adsorption on Hard Surfaces 2. Meeting in Physics, 2006: “Electrochemical Studies of the Adsorption of Ferritin and Albumin on AU Surface” 3. 6-th International Conference of the Balkan Physical Union, Turkey, Istanbul, 2006, Electrochemical and Ellipsometrical Studies of the Adsorption Kinetics of Ferritin and Serum Albumin on Gold Surface, Book of Abstracts, 16-P-037, p.1157. Публикации във връзка с дисертацията 1. Electrochemical and Ellipsometrical Studies of the Adsorption Kinetic of Ferritin and Albumin on Gold Surface L.Vladimirova,V. Savov Journal American Institute of Physics, 2007, (Proceedings, приета за печат) 2. Ellipsometrical Investigation of the Adsorption of Ferritin and Albumin on Gold Surface A. Gritzkov, L. Vladimirova, V. Savov (Подготвена за печат) 3. Electrochemical Studies of the Adsorption Kinetics of Ferritin and Albumin on gold Surface L. Vladimirova, V. Kochev, V. Savov

БЛАГОДАРЯ!