Non spontanee spontanee  G>O  G<O

 Nelle cellule, le singole reazioni enzimatiche fanno parte di sequenze a più tappe chiamate vie metaboliche.  In una via metabolica, il prodotto di una reazione funge da substrato nella reazione successiva.  Si definisce metabolismo l’insieme di queste vie metaboliche.  Le vie metaboliche vengono classificate in:  - cataboliche (demolitive)  - anaboliche (sintetiche).

Le vie cataboliche Le reazioni cataboliche disgregano le molecole complesse (proteine, polisaccaridi, lipidi) producendo poche molecole semplici come CO 2, NH 3 ed H 2 O. Servono a catturare, sotto forma di ATP, l’energia chimica liberata dalla degradazione di molecole combustibili. La liberazione di energia nella degradazione di molecole complesse avviene in 3 stadi: I) l’idrolisi delle molecole complesse II) conversione dei monomeri in molecole più semplici III) ossidazione dell’acetil CoA Il catabolismo è un processo convergente (una grande varietà di molecole si trasforma in pochi prodotti finali comuni). Le reazioni cataboliche disgregano le molecole complesse (proteine, polisaccaridi, lipidi) producendo poche molecole semplici come CO 2, NH 3 ed H 2 O. Servono a catturare, sotto forma di ATP, l’energia chimica liberata dalla degradazione di molecole combustibili. La liberazione di energia nella degradazione di molecole complesse avviene in 3 stadi: I) l’idrolisi delle molecole complesse II) conversione dei monomeri in molecole più semplici III) ossidazione dell’acetil CoA Il catabolismo è un processo convergente (una grande varietà di molecole si trasforma in pochi prodotti finali comuni).

Champe et al., Le basi della biochimica, Ed. Zanichelli

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La regolazione del metabolismo Le vie metaboliche devono essere coordinate in modo che la produzione di energia o la sintesi dei prodotti finali rispondano ai reali bisogni delle cellule. Le singole cellule non lavorano isolatamente ma fanno parte di una comunità di tessuti interagenti. I segnali regolatori comprendono: ormoni, neurotrasmettitori, disponibilità di nutrienti. Le vie metaboliche devono essere coordinate in modo che la produzione di energia o la sintesi dei prodotti finali rispondano ai reali bisogni delle cellule. Le singole cellule non lavorano isolatamente ma fanno parte di una comunità di tessuti interagenti. I segnali regolatori comprendono: ormoni, neurotrasmettitori, disponibilità di nutrienti.

 I segnali che si generano all’interno di una cellula (segnali intracellulari) producono risposte rapide e regolano istante per istante il metabolismo.  La segnalazione tra cellule (intercellulare) produce risposte più lente. La comunicazione più importante è quella mediata da ormoni o neurotrasmettitori.  Il legame di un ormone o di un neurotrasmettitore ad un recettore innesca una serie di reazioni che hanno come risultato finale una specifica risposta intracellulare. I secondi messaggeri fanno parte di questa cascata di eventi.

Adenilato ciclasi  Il sistema dell’adenilato ciclasi è particolarmente importante nella regolazione delle vie del metabolismo intermedio.  Il legame di ormoni o neurotrasmettitori ai recettori specifici innesca un aumento o una diminuzione dell’attività dell’adenilato ciclasi.  L’adenilato ciclasi è un enzima legato alla membrana che converte l’ATP in 3’,5’-adenosina monofosfato (AMP ciclico o cAMP).  I recettori che agiscono attraverso l’adenil ciclasi hanno: a) una regione extracellulare, che riconosce il ligando b) 7 eliche transmembranali c) un dominio intracellulare che interagisce con le proteine G.

Le proteine G  Sono proteine trimeriche localizzate nella membrana cellulare, associate ai recettori.  Sono così chiamate perché legano i nucleotidi guanosinici (GTP e GDP).  Sono il primo degli anelli di comunicazione tra recettore di membrana ed adenilato ciclasi.  Normalmente sono in forma inattiva (proteina G legata al GDP).  Il recettore attivato (dal legame con un ormone o neurotrasmettitore) interagisce con le proteine G scambiando il GDP col GTP (proteina G attiva).  Sono proteine trimeriche localizzate nella membrana cellulare, associate ai recettori.  Sono così chiamate perché legano i nucleotidi guanosinici (GTP e GDP).  Sono il primo degli anelli di comunicazione tra recettore di membrana ed adenilato ciclasi.  Normalmente sono in forma inattiva (proteina G legata al GDP).  Il recettore attivato (dal legame con un ormone o neurotrasmettitore) interagisce con le proteine G scambiando il GDP col GTP (proteina G attiva).

 La proteina G attivata si dissocia nella subunità a e nel dimero bg.  La subunità a si sposta verso l’adenil ciclasi, attivandola.  Per ogni molecola di recettore attivato si formano molte molecole di proteina G attiva.  L’azione del complesso proteina G-GTP è di breve durata.  Le proteine G hanno un’attività GTPasica intrinseca, che provoca l’idrolisi del GTP in GDP con conseguente inattivazione della proteina G e dell’adenilato ciclasi.

Champe et al., Le basi della biochimica, Ed. Zanichelli

La capacità di un ormone di stimolare o inibire l’adenilato ciclasi dipende dal tipo di proteina G che si trova legata al recettore. La famiglia delle proteine Gs è specifica per l’attivazione dell’adenilato ciclasi mentre la famiglia designata Gi provoca l’inibizione dell’enzima. Il complesso “proteina G-GTP” ha una breve durata: le proteine G hanno attività GTPasica intrinseca idrolisi del GTP in GDP inattivazione della proteina G e dell’adenilato ciclasi.

Il cAMP attiva una famiglia di enzimi chiamati proteina chinasi cAMP dipendenti. Essi catalizzano il trasferimento del fosfato dall’ATP a specifici residui di serina o treonina di substrati proteici. Le proteine fosforilate possono agire direttamente sui canali ionici della cellula oppure, se sono enzimi, possono essere attivati o inattivati. N.B. Non tutte le proteina chinasi dipendono dal cAMP (p.es. la proteina chinasi C).

DEFOSFORILAZIONE DELLE PROTEINE Le variazioni delle attività enzimatiche indotte dalla fosforilazione delle proteine non sono permanenti. Le proteina fosfatasi, enzimi che idrolizzano gli esteri fosforici, rimuovono i gruppi fosfato aggiunti dalle proteina chinasi. IDROLISI DEL cAMP Il cAMP è idrolizzato rapidamente a 5’-AMP dalla cAMP fosfodiesterasi, che rompe il legame fosfodiestere ciclico 3’-5’ (il 5’-AMP non è una molecola di segnale). N.B. La fosfodiesterasi è inibita da derivati della metilxantina (teofillina e caffeina).

Metabolismo meccanismi di regolazione Livelli di Enzima Attività Enzimatica Compartimentalizzazione cellulare  Molecole trasportatrici Controllo ormonale

Muscolo scheletrico Periodi di bassa richiesta di E Periodi di alta richiesta di Energia (dal glicogeno) ≠ Muscolo cardiaco Continua necessità di E per una contrazione regolare: glucosio completamente ossidato Completamente ossidato

UDP-Glucuronato + R-OH  R-O-Glucuronato + UDP Composti apolari coniugati con accettori non polari per formare composti più polari - composti endogeni: bilirubina, ormoni steroidei, T3 - composti esogeni: farmaci G1P + UTP  UDPGlucosio (UDPG) sintesi del glicogeno UDP-Glucuronato + 2 NAD +

LIVELLI DI CONTROLLO DEL METABOLISMO IMMEDIATO non richiede energia - flusso del substrato (controllato da Km) - regolazione allosterica prodotto (inibizione a feed back) metaboliti H + ; Ca +2 A BREVE TERMINE (MINUTI) - RICHIEDE ENERGIA modificazione covalente (fosforilazione - defosforilazione di proteine) A LUNGO TERMINE (ORE) - RICHIEDE ENERGIA Modificazione dei livelli proteici tramite - biosintesi proteica - degradazione proteica

Controllo della glicolisi A LUNGO TERMINE A BREVE TERMINE - controllo allosterico - ciclo dei substrati - modificazione covalente - modificazione dei livelli enzimatici

Fosfofruttochinasi  ATP  AMP  Ca 2+  CITRATO  H +  F2,6bisP (insulina) F1,6bisP fosfatasi  AMP  F2,6BP Controllo allosterico Glicogeno fosforilasi  ATP  AMP  Ca 2+  G6P Glicogeno sintasi  ATP  G6P

Muscolo ATP/AMP  50 ATP/ADP  10 Controllo allosterico e Ciclo dei substrati ATP 5 mM  10%4,5 mM AMP 0,1 mM  600% 0,6 mM L’aumento dell’AMP comporta un aumento di 10 volte dell’attività della PFK contemporaneamente calo di 10 volte della attività della fosfatasi RISULTATO: aumento 100 volte del flusso glicolitico

Gli enzimi sono catalizzatori modulabili Sintesi e degradazione della proteina Stimolazione o inibizione da parte di:  piccole molecole (metaboliti, ioni)  grosse molecole (proteine, acidi nucleici) Stimolazione o inibizione mediante modifiche covalenti reversibili

Regolazione Regolazione allosterica (positiva e negativa) Regolazione per modificazione covalente (positiva e negativa)

Non tutti gli enzimi sono di tipo michaeliano vovo concentrazione di S Vmax enzima allosterico

in conclusione controllo metabolico = controllo cinetico gli enzimi = catalizzatori modulabili gli enzimi = sensori molecolari con attività catalitica controllo cinetico = controllo enzimatico

Termodinamica del metabolismo Irreversibilità del processo Reazione di controllo Catabolismo e anabolismo usano vie diverse

Controllo del flusso metabolico  Controllo allosterico  modificazione covalente  vie metaboliche cicliche  controllo genetico

Principali vie del catabolismo e compartimenti cellulari

SEGNALI CHIMICI EXTRACELLULARI hanno un meccanismo generale comune CONTROLLO ORMONALE NEUROTRASMISSIONE OLFATTO GUSTO VISTA CRESCITA DIFFERENZIAMENTO

NATURA CHIMICA degli ORMONI POLIPEPTIDICA insulina, glucagone, ormoni ipofisari paratormone AMMINOACIDICA (dalla tirosina) adrenalina, ormoni tiroidei STEROIDEA -composti lipofili, -richiedono trasportatori ematici - si legano a recettori intracellulari ormoni sessuali corticosurrenalici 1,25-diidrossi colecalciferolo o 1,25 (OH) 2 D 3

RXR Complesso coattivatore DNA Trascrizione basale I recettori per gli ormoni steroideI formano eterodimeri con RXR recettore per l’acido retinoico (derivato Vit A) Extrac. citoplasma nucleo

MECCANISMI DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE DI ADRENALINA E DI ORMONI POLIPEPTIDICI (Glucagone)

I. SEGNALE: ORMONE RECETTORE (membrana) legame 1:1 R-ormone II. TRASDUZIONE (membrana) amplificazione del segnale tramite enzimi proteine G, adenilato ciclasi, fosfolipasi C III. SECONDI MESSAGGERI (citoplasma, membrana) AMPc, Ca 2+, inositolo 1,4,5,trifosfato, diacilglicerolo IV. PROTEIN CHINASI; FOSFOPROTEIN FOSFATASI V. RISPOSTA CELLULARE attivazione enzimi, fattori di trascrizione, canali di membrana

DISATTIVAZIONE (se permane il legame R.. ormone) 1. la “chinasi del recettore  -adrenergico” riconosce la forma attiva 2. il recettore viene fosforilato (R-P) 3. la proteina  -arrestina lega il R-P 4. si interrompe l’interazione con le proteine G Recettore  -adrenergico (R) R + ormone  R.. ormone conseguente cambio conformazionale del recettore

adenilato ciclasi inattiva adenilato ciclasi attiva Subunità  : lenta attività GTPasica (sec) L’idrolisi del GTP funge da orologio incorporato che spontanemante riporta allo stato inattivo La tossina colerica blocca nella forma attiva La tossina della pertosse inattiva il sistema

- PROTEIN CHINASI Ser/Thr, Tyr Premio Nobel 1992 Dal genoma si calcola differenti protein chinasi - PROTEIN FOSFATASI

Glucagone Adrenalina Paratormone ACTH, LH, FSH membrana cellulare adenilato ciclasi attiva ATP cAMP inibita da caffeina teofillina AMP R R C C Protein chinasi A PKA (C 2 R 2 ) fosforila residui di Ser + 4 cAMP 2 R -cAMP + 2 C proteina fosfoproteina + ATP fosfatasi EFFETTI FISIOLOGICI Fosfodiesterasi

Tossina colerica B A 5 subunita B A1 + A2 B si lega alla membrana della mucosa intestinale A entra all’interno della cellula e blocca proteine G nella forma attiva catalizza la ADP ribosilazione delle proteine G Subunità  -Arg-Ribosio -P-P Ribosio - Adenina (ADPribosio) AMPc 100 volte più elevato  PKA  apertura canali per il Cl - ed eccessiva perdita di NaCl e H 2 O Diarrea con perdita di 1 litro/h acqua ricca di sali REIDRATAZIONE CON SALI E GLUCOSIO

acetilcolina, vasopressina, ossitocina, neurotrasmettitori membrana Fosfatidil inositolo 4,5 bisfosfato (PIP 2 ) FOSFOLIPASI C diacilglicerolo (DAG) ( apolare) regolatore di PKC- Ca 2+ fosforila Ser/Thr inositolo 1,4,5,trisfosfato (IP 3 ) (polare idrosolubile)  Rilascio di Ca 2+ dal R.E.  Protein chinasi C (PKC) forma solubile PKC- Ca 2+ trasloca sulla membrana secondi messaggeri sinergici

Recettore dell’insulina famiglia delle tirosinchinasi Tetramero  2  2 alfa extracellulare: sito di legame dell’insulina beta intracellulare: attività chinasica I. Legame dell’insulina attiva autofosforilazione di residui di Tyr II. La forma fosforilata ha attività chinasica verso altre proteine intrac

insulina P p IRS-1 ( substrato 1 del recettore dell’ insulina) la sua fosforilazione induce trasporto glucosio muscolo, tessuto adiposo GLUT-4 biosintesi glicogeno biosintesi acidi grassi biosintesi proteine effetti mitogeni, espressione genica membrana

Insulina stimola la fosfodiesterasi con calo livelli di AMPciclico stimola fosfoprotein fosfatasi

IPOGLICEMIA  GLUCAGONE  Glicogenolisi attivata fosforilasi, inibita glicogeno sintasi  Gluconeogenesi attivata fruttosio 1,6 bisfosfatasi inibita fosfofruttochinasi IPERGLICEMIA  INSULINA  Importo glucosio (GLUT 4)  Glicogenolisi inibita fosforilasi, attivata glicogeno sintasi  Glicolisi

fosforilasi chinasi (  ) 4 subunità catalitica   siti di fosforilazione  calmodulina (lega Ca 2+ )  FOSFORILASI b inattiva FOSFORILASI a attiva GLUCAGONE, ADRENALINA  adenilato ciclasi  cAMP  protein chinasi A (PKA) GLICOGENO SINTASI-P (inattiva) PROTEIN FOSFATASI -P (inattiva)

Fosforilasi b Fosforilasi a controllo allosterico immediato dipende da carica energetica Forma R attiva Forma T poco attiva AMP ATP G6P Fosforilasi chinasi 2 ATP 2 ADP Fosfoprotein fosfatasi -P P- -P P- controllo covalente ormonale non soggetto a regolazione allosterica ATP/AMP regolazione allosterica scavalcata da quella ormonale se è richiesta risposta prolungata

Insulina induce defosforilazione attiva - PROTEIN FOSFATASI - GLICOGENO SINTASI forma defosforilata attiva denominata: Forma I indipendente da regolazione allosterica Viceversa Glicogeno sintasi poco attiva nella forma fosforilata denominata: Forma D dipendente da regolazione allosterica

Controllo ormonale: Gluconeogenesi epatica - Fosfofruttochinasi-2 (PFK-2) - Fruttosio 2,6bisfosfatasi-2 (FBPasi-2) Domini diversi dello stesso enzima bifunzionale enzima defosforilato.  dall’ insulina fosfoenzima  dal glucagone ATP + F6P F2,6 bisP + H 2 O Attiva fosfofruttochinasi Inibisce fruttosio 1,6 bis fosfatasi

F6P + ATP + enzima defosforilato attivo  F2,6 bisP + H 2 O attiva fosfofruttochinasi inattiva fruttosio 1,6 bis fosfatasi AUMENTA GLICOLISI e DIMINUISCE GLUCONEOGENESI in presenza di insulina In presenza di glucagone F6P + ATP  fosfoenzima inattivo + F2,6 bisP + H 2 O inattiva fosfofruttochinasi attiva fruttosio 1,6 bis fosfatasi DIMINUISCE GLICOLISI e AUMENTA GLUCONEOGENESI AUMENTA GLICEMIA

INSULINA Aumenta sintesi dell’enzima piruvato chinasi ed aumenta il flusso glicolitico (per dare precurosi per la sintesi degli acidi grassi). GLUCOCORTICOIDI Aumenta sintesi dell’enzima fosfoenolpiruvato carbossichinasi ed aumenta la gluconeogenesi. Regolazione tramite l’aumento o la diminuizione dell’ espressione di geni che codificano per enzimi chiave.