Proteínas de fusión 2 problemas principales con la expresión de proteínas foráneas Degradación Purificación

Proteínas de fusión Degradación Una solución para la degradación produce un nivel bajo de expresión es dificil la purificación de la proteína deseada Una solución para la degradación Unir la proteína target a una proteína celular estable (tag o carrier)

Proteínas de fusión Proteína de fusión (a nivel DNA o genes) Región que codifica una proteína celular fusionada en marco de lectura a la región que codifica para la proteína target Cuando se transcribe y traduce genera una proteína de fusión

Proteínas de fusión Carrier o tag en el extremo -NH2 o –COOH de la proteína - un dominio con actividad catalítica - un dominio antigénico - una señal peptídica topogénica protege de proteólisis a la proteína de interés mejora la solubilidad de la proteína estabiliza a la proteína de interés

Proteínas de fusión stable gene gene of interest MET ... LEU ARG THR MET VAL ILE ... End ATG ... GTG CGA ACC ATG GTG ATC ... TAG Nco I Note: translation stop of cellular gene must be removed Note: reading frame of fusion protein must be contiguous

Proteínas de fusión Clivado por proteasas Clivan una corta y definida secuencia de aa La secuencia de clivado para la proteasa entre el gen carrier y el gen de interés protease cleavage sequence fusion partner gene of interest

Sitio de clivado para el Factor Xa

Purificación de proteínas de fusión La proteína de fusión se une a una molécula pequeña o anticuerpo (Ab) La molécula pequeña o Ab pueden estar unidos a una matriz inerte La proteína de fusión se unirá, las otras no La proteína purificada se eluirá de la columna

Purificación por cromatografía de afinidad 3 1 2 4

Proteínas de fusión A veces la sobreexpresión puede reducir la cantidad de proteína recuperada La proteína forma agregados insolubles: Cuerpos de inclusión La formación de agregados puede deberse a un plegamiento incorrecto

Proteínas de fusión Soluciones a la formación de cuerpos de inclusión proteína de fusión con tioredoxina (soluble) Proteína de fusión con péptido señal, por ej. de la fosfatasa alcalina (periplasma) Tratamiento con agentes caotrópicos (urea, cloruro de guanidinio)

pRSET Expression Vector The pRSET vector is designed for high-level prokaryotic expression controlled by the strong bacteriophage T7 promoter. Expression is induced by the production of T7 RNA polymerase in the BL21(DE3)pLysS host E. coli cells. These cells also produce T7 lysozyme to reduce basal expression of target genes. The pRSETvector offers: High-level expression from the bacteriophage T7 promoter T7 gene 10 sequence to provide protein stability N-terminal polyhistidine (6xHis) tag for rapid purification with ProBond® resin N-terminal Xpress® epitope for protein detection with the Anti-Xpress® Antibody Enterokinase cleavage site for removal of fusion tag f1 origin for ssDNA rescue to allow easy sequencing and mutagenesis